Những mẫu rắn, đục hay khó để ánh sáng truyền qua có thể chặn hay làm phân tán ánh sáng, từ đó hạn chế sự chính xác của đáp ứng đo. Hệ thống quang cần cấu hình đặc biệt khi xử lý những mẫu này để có thể để xác định được độ phản xạ, biểu hiện độ hấp thụ. Điều này lại đòi hỏi thiết kế đặc biệt từ ban đầu và dụng cụ thao tác mẫu, và giá thành của chúng có thể lớn hơn quang phổ kế.<o
></o
>
<o
> </o
>
Hiểu được giới hạn trong thiết bị của bạn<o
></o
>
Các thiết bị có giá tầm 10 ngàn $ có thể tạo được tín hiệu là độ hấp thụ có khả năng lặp lại trong khoảng 0.001 - 0.01, nhưng thiết bị trong hầu hết các phòng thí nghiệm đều không làm được điều này. Mẫu siêu loãng phân tích tốt hơn khi sử dụng giếng có đường truyền sáng dài hoặc
bộ điều khiển độ dài sóng cố định đặc hiệu cao (fixed wavelength monitor of high specification). Cuvette có thể tích mẫu nhỏ có thể làm giảm hoặc loại trừ yêu cầu phải pha loãng mẫu.
<o
> </o
>
Thiết bị có khả năng tạo ra độ hấp thụ có thể lặp lại được có giá trị nhỏ tới mức nào? Hãy tạo một đường chuẩn để trả lời câu hỏi này. Chú ý rằng có thể tạo ra giá trị độ hấp thụ có khả năng lặp lại, nhưng nếu không nằm trên đường chuẩn, nó có thể không tương ứng với nồng độ.
<o
> </o
>
Điều gì góp phần tạo ra tín hiệu A260 và A280 không chính xác?<o
></o
>
<o
> </o
>
Các vấn đề về thiết bị<o
></o
>
Những bóng UV lâu năm, yếu có thể tạo ra tín hiệu không chính xác, cũng như một bóng deuterium mới không cung cấp nhiệt đúng cách (các thiết bị cũ cần 20-40 phút). Các thiết bị được sản xuất trong vòng 10 năm thì khởi động không phải là một vấn đề, nhưng thường phải mất 10 phút và có thể cần thêm tự căn chỉnh (yêu cầu khi làm GLP). Sẽ trình bày về chức năng bóng chi tiết hơn trong phần sau.<o
></o
>
<o
> </o
>
Nồng độ mẫu<o
></o
>
Phép đo mẫu pha loãng gần với giới hạn độ nhạy của quang phổ kế thường gây ra vấn đề đặc biệt đối với các giá trị A280.<o
></o
>
Sự thay đổi đột ngột (sharp changes- đột ngột, sắc nét…?) ở lân cận của 280nm (Hình 4.13) làm tăng
độ sai lệch của độ hấp thụ (amplify any absorbance inaccuracy).
<o
> </o
>
Các chất nhiễm<o
></o
>
Muối, dung môi hữu cơ, và protein nhiễm có thể làm tăng độ hấp thụ thực có khi đo tại 260nm. Có thể kiểm tra chất nhiễm và đôi khi định lượng được bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng xác định. Xác định ảnh hưởng dư trên phổ bằng cách đổi
tỉ lệ hấp thụ liên quan (relevant absorbance ratio) (A11/A12) như trong hình 4.14.<o
></o
>
<o
> </o
>
Độ hấp thụ tại 230nm<o
></o
>
Có thể xác định độ hấp thụ của Tris, EDTA, và muối đệm khác khi đo tại 230nm do nucleotide và ribonucleotide thường có độ hấp thụ nhỏ nhất tại vùng ánh sáng này. Vùng 230 nm cũng gần với cực đại hấp thụ của liên kết peptide nên sẽ chỉ ra sự có mặt của protein. Do đó, giá trị thu được tại 230nm hoặc ở vùng lân cận chỉ ra khả năng nhiễm trong quá trình chuẩn bị nucleic acid. Giá trị hấp thụ cao tại 230nm chỉ ra độ tinh sạch đáng ngờ của mẫu nucleic acid. Khi chuẩn bị RNA mà có sử dụng guanidine thiocyanate, mẫu tách nên có tỉ lệ A260/A230 lớn hơn 2. Tỉ lệ thấp hơn thường chứng tỏ rằng mẫu đã bị nhiễm với guanidine thiocyanate trong quá trình chuẩn bị.<o
></o
>
<o
> </o
>
Độ hấp thụ tại 320nm<o
></o
>
Nucleic acid và protein gần như không hấp thụ tại 320nm, mặc dù sự hấp thụ trong khoảng 300 và 350 nm có thể biểu hiện cho kết tủa trong trường hợp của protein. Việc trừ đi độ hấp thụ tại 320nm từ độ hấp thụ tại 260nm có thể loại đi sự hấp thụ do nhiễm chloroform, ethanol, acetate, citrate và những hạt gây đục. Độ hấp thụ nền tại 320 nm gần như làm lệch các giá trị A260 của dung dịch nucleic acid loãng hoặc của các mẫu trong cuvette có thể tích rất nhỏ.<o
></o
>
<o
> </o
>
Độ hấp thụ có luôn tỉ lệ tương ứng với nồng độ hay không?<o
></o
>
Quy luật Beer-Lambert (Biochrom Ltd.,1997) đưa ra quan hệ trực tiếp giữa nồng độ chất, như nucleic acid và protein, và độ hấp thụ của chúng. Do đó biểu đồ về độ hấp thụ theo nồng độ sẽ là đường thẳng đi qua gốc. Khi
đường đồ thị thẳng (in straight line conditions), có thể xác định nồng độ chưa biết của mẫu từ giá trị hấp thụ của nó và giá trị hấp thụ của nồng độ nucleic acid và protein đã biết (hoặc
một yếu tố căn chỉnh tương ứng khác-an appropriate calibration factor).<o
></o
>
<o
> </o
>
Khi đường biểu thị độ hấp thụ và nồng độ theo quy luật Beer-Lambert không thẳng, không thể đo chính xác DNA và protein mà chỉ sử dụng một yếu tố (như
độ hấp thụ phân tử - molar extinction coefficient or molar absorptivity http://en.wikipedia.org/wiki/Molar_absorptivity) hay nồng độ để căn chỉnh. Để chính xác nhất, phải căn chỉnh giá trị hấp thụ với những nồng độ đã biết mà tương ứng với nồng độ mẫu. Phổ chuẩn căn chỉnh nên chứa nồng độ mẫu, những nồng độ này được đo để bù một cách phù hợp cho những giá trị ngoài đáp ứng đường chuẩn. Sự lệch ra khỏi đường thẳng là do ba ảnh hưởng chính sau trong quá trình thí nghiệm: thay đổi trong sự hấp thụ ánh sáng, tác động của thiết bị, và thay đổi về hóa tính.
<o></o>
<o
> </o
>
Những thay đổi trong hấp thụ ánh sáng được tạo ra do những tác động lên chỉ số khúc xạ trong dung dịch trong khi đo. Chỉ số này không đổi trong dung dịch có nồng độ thấp nhưng lại có thể thay đổi khi nồng độ muối đệm trên 0.001M. Điều này không ảnh hưởng tới quá trình định lượng bởi có thể căn chỉnh phép đo bằng
hệ dung dịch chuẩn (bracketing standard solutions) hay đường chuẩn.<o
></o
>
<o
> </o
>
Những ảnh hưởng về thiết bị tăng nếu ánh sáng qua mẫu không đơn sắc hoàn toàn, điều này đã được đề cập phía trên trong phần độ rộng dải tần quang phổ. Quy luật Beer-Lambert dựa trên ánh sáng đơn sắc, nhưng trong thực tế sẽ tạo ra một phổ bước sóng đi qua mẫu và có độ hấp phụ khác nhau tương ứng khi đặt một bước sóng. Kết quả là ảnh hưởng tới lượng ánh sáng đo được và nó sẽ không tỉ lệ với nồng độ, tạo ra sai số âm từ đường đồ thị tại mức ánh sáng nhỏ hơn do nồng độ lớn hơn. Chỉ nhận thấy rõ ràng ảnh hưởng này trong trường hợp các đỉnh hấp thụ hẹp khi so với độ rộng dải quang phổ; nó không phải là vấn đề với chế độ đặt đặc trưng mà đã được trình bày trong phần trước.
<o
> </o
>
Sai lệch hóa tính tăng khi giá trị cực đại bước sóng thay đổi do điều kiện dung dịch. Một số nucleic acid bị ảnh hưởng khi dung dịch đệm thay đổi pH mà đưa ra sự thay đổi bước sóng lên tới 5nm. DNA từ mạch kép sang mạch đơn làm tăng độ hấp thụ
(độ đậm quang học - hyperchromicity) làm thay đổi cường độ hấp thụ tại 260nm. Trong thực tế, nên phá đông mẫu DNA đúng cách, ủ tại nhiệt độ cao (80–90°C) và làm lạnh từ từ trước khi đo.<o
></o
>
<o
> </o
>
Khi định lượng nucleic acid và protein tại 280nm tại sao thường làm việc trong dải hấp thụ 0.1-0.8 tại 260 nm?<o
></o
>
<o
> </o
>
Hầu hết quang phổ kế tốt sẽ tạo ra đáp ứng tuyến tính (độ hấp thụ và nồng độ) trong khoảng giá trị hấp thụ 0.1-0.8 nên người ta thấy rằng phổ này an toàn khi định lượng mẫu. Nếu bạn làm việc ngoài phổ này, quan trọng là bạn tạo ra đường chuẩn có đủ lượng điểm chuẩn để chứng tỏ mối liên hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ là tin cậy và có tính thống kê.<o
></o
>
Phải thực hiện một nghiên cứu căn chỉnh tương tự như thế với cuvette bạn sử dụng. Thiết kế, chất lượng, và độ dài đường truyền sáng của cuvette có thể ảnh hưởng tới tín hiệu trong thí nghiệm căn chỉnh này.
Việc tính toán nồng độ protein và peptide cũng cần đường tuyến tính của đáp ứng và áp dụng những nguyên tắc tương tự trong các phép đo chúng (Calculations of protein and peptide concentration also require linearity of response and the same principles apply to their measurements).<o
></o
>
Đèn deuterium có thể tạo ra đáp ứng tuyến tính lên tới ba đơn vị của độ hấp thụ đáp ứng tuyến tính này của các đèn xenon giảm gần hai đơn vị hấp thụ (Deuterium lamps can generate linear responses up to three units of absorbance;the linear response of xenon lamps decreases at approximately two units of absorbance.).<o></o>
<o
> </o
>
. Em làm gì xấu/trái luật đều bị trừng phạt 
(kinh nghiệm xương máu 
) nên mong các bác thông cảm.
.
. <o
