Dịch cuốn MOLECULAR BIOLOGY PROBLEM SOLVER

[Nguyễn Xuân Hưng]

bản vi độ chuẩn (micro titer plates)

nồi hấp tiệt trùng (autoclave)

trasitor đặc biệt trong trường hợp điện cực trasitor ảnh hưởng bởi vùng đặc hiệu ion (ion specific field effect transistor ISFET hoặc FET)

Đoạn cuối em thấy hơi khó dịch. Các bác đọc thấy chỗ nào ngang thì xem lại giúp. Em post lên cả đoạn. Cảm ơn ạ

Nonrefillable electrodes are less costly and require low mainte-
nance. They may be submersible as there is no hole on the side
that must have atmospheric pressure to cause the filling solution
to flow.They usually have a fiber or wick junction for the gelled
filling solution to leak outside and this flow cannot be stopped.
Often these junctions exhibit a “sample memory”which is due to
backflow of sample material into the electrode. Several double-
junction, low-maintenance electrodes utilize a high-performance
polymer for the internal filling solution. These electrodes have
open junctions,where the polymer fills a hole in the glass and the
silver/silver chloride reference is isolated from the sample by the
polymer.These electrodes also can be used with commercial pro-
duction samples since the silver never contacts the sample,just the
gel which has no silver in it. While some polymer systems are
prone to hydrolysis, these electrodes offer longer lifetimes, low
maintenance and advanced features.

1. Không nên dịch là tự nhận đệm, dịch là định chuẩn tự động là đúng rồi.

2.microtiter plates = đĩa vi chuẩn độ. Dịch vậy cho kêu chứ thật ra nó là cái đĩa 96 giếng dùng để làm ELISA ý mà

nồi hấp tiệt trùng (autoclave) --> đúng rồi

3. Về cơ bản Nonrefillable electrode khác refillable electrode ở chỗ 1 cái có thể thay dung dịch bên trong còn cái kia thì không hay nói cách khác 1 cái có khả năng tái tạo, cái kia thì không.

Thôi thì dịch tạm là điện cực khả tái tạo và điện cực không tái tạo vậy.

4. Điện cực không tái tạo thường rẻ hơn và ít cần bảo dưỡng.

Có thể nhúng chìm loại điện cực này do chúng không mang khe hở bên sườn (khe này cần để áp suất khí quyển có thể tiến vào và làm chuyển động dung dịch trong điệc cực khả tái tạo).

Chúng thường có mối nối dạng sợi hoặc bấc để dung dịch điện cực dạng gel có thể chảy liên tục ra ngoài.

Thông thường, những mối nối này có khả năng "nhớ mẫu” do mẫu cũng chảy ngược vào bên trong điện cực.

Nhiều điện cực (với mối nối kép và ít cần bảo dưỡng) sử dụng polymer hiệu năng cao làm dung dịch bên trong.

Những điện cực này có mối nối mở, nơi mà polymer bao phủ khe hở trên thành và ngăn cách điện cực chuẩn Ag/AgCl với mẫu.

Cũng có thể sử dụng điện cực loại này cho các mẫu thương phẩm do mẫu không tiếp xúc với bạc mà chỉ tiếp xúc với gel không chứa bạc.

Mặc dù một số hệ thống polymer có thể bị thủy phân, những điện cực này lại có tuổi thọ cao, ít cần bảo dưỡng và mang những đặc tính tân tiến.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Bác nào còn giữ sách hóa hay thân với bạn nào học hóa giúp em xem lại nghĩa mấy từ này với. Em dịch phần này nhưng không biết dùng nghĩa tiếng Việt nào cho phù hợp.
vật chuẩn (reference material???)
Điện cực có thể thay dịch được giữ ẩm (với khe hở được đậy lại) cần mở khe này để tạo ra dòng chảy dương tại mối nối (Refillable electrodes (which is) stored wet with their fill hole covers closed/ need the fill hole opened to create a positive flow at the junction – em chả hiểu câu này viết gì cả)
flow (???) (junctions flow)

reference material = vật chuẩn, mẫu chuẩn

Refillable electrodes (which is) stored wet with their fill hole covers closed/ need the fill hole opened to create a positive flow at the junction

Câu trên họ nói là điện cực khả tái tạo giữ khô ráo không tốt do chất lỏng bên trong bị bay hơi, vì vậy cần giữ ướt. Do đó câu dưới cần dịch là:

Do khi bảo quản ướt điện cực khả tái tạo thì khe đổ (fill hole) được đóng đại nên lúc vận hành cần mở nó ra để tạo dòng chảy tại mối nối.

 

[happyfly]

Em ngại xuất hiện với tên cúng cơm nên sẽ có đồng chí happyfly này thay thế để tránh bị hỏi thăm và lên trang nhất các báo. Em làm gì xấu/trái luật đều bị trừng phạt (kinh nghiệm xương máu ) nên mong các bác thông cảm.

 

[happyfly]

Cảm ơn các bác, em sửa rồi. Dài quá.
More often than not, the factory-set calibration on a pipette is changed before a proper inspection and cleaning has been performed = thông số chuẩn do nhà sản xuất đặt trên pippet thường bị thay đổi trước khi việc kiểm tra và làm sạch đúng đắn được thực hiện: Thường việc căn chỉnh chuẩn đặt trên pippet do nhà sản xuất đã bị thay đổi trước khi thực hiện kiểm tra và làm sạch theo đúng cách.
<o> </o>
O ring: đúng là nên dịch thành gioăng tròn vì phải phân biệt với X ring nữa .

Cũng tán thành với bác Hưng về từ auto buffer recognition: tự động định chuẩn<o></o>
<o> </o>
Seal: em google nó toàn ra con hải cẩu ???: ). Nghĩ ra sớm thì lên lab hỏi, có người chỉ dẫn nữa chứ . <o></o>
<o> </o>
Gravimetric testing of pipettes refers to the technique of weighing a dispensed amount of liquid, changing the weight to a volume, and then determining if the volume is within the manufacturer’s stated specifications

= Kiểm tra pippet theo phương pháp trọng lượng là kỹ thuật cân một lượng chất lỏng do nhà cung cấp phân phối, au đó chuyển đổi khối lượng cân được thành thể tích và xác định xem thể tích này có nằm trong tiêu chuẩn kỹ thuật của nhà sản xuất hay không: Phân tích khối lượng sẽ xác định được lượng thể tích phân phối chất lỏng của pipette. Sau khi chuyển khối lượng về thể tích sẽ xác định lượng thể tích đó có trong tiêu chuẩn kĩ thuật nhà sản xuất đưa ra hay không.<o></o>

 

[happyfly]

Thực hiện như đối với từng hệ thống hiện có sau đây.<o></o>
Các hệ thống hiện có<o></o>
Kiểm tra dung dịch chuẩn <o></o>
Tốt nhất là đổ dung dịch với mức thấp hơn khe đổ vào lúc đầu giờ làm hay khi còn rất ít dung dịch. Cần cân bằng điện cực với dung dịch mới do nhiệt độ và thành phần trong điện cực có thay đổi đôi chút.<o></o>
<o> </o>
Nên căn chỉnh hệ thống máy đo và điện cực ngay đầu giờ của ngày sử dụng và sau đó khoảng 2 giờ một lần hoặc khi nghi ngờ về việc thực hiện của điện cực. Nên căn chỉnh thường xuyên bởi thành phần mẫu có thể di chuyển vào dung dịch nếu dòng không đủ hoặc tạm ngừng trong một thời gian. Nếu giá trị pH hiện lên chậm, dung dịch trông bẩn hay có hiện tượng bất thường, hay mẫu làm tắc mối nối, nên đổi dung dịch. Khi bảo dưỡng định kì, nên tháo dung dịch khỏi điện cực và thay dung dịch mới.<o></o>
<o> </o>
Căn chỉnh hệ thống<o></o>
Nên căn chỉnh pH kế tại nhiều điểm ngay vào đầu giờ làm và sau đó 2 giờ 1 lần để kết quả được chính xác. Thủy tinh cảm ứng của điện cực, dung dịch, và mối nối có thay đổi đôi chút trong quá trình phân tích mẫu và phải tính tới điều này khi tái căn chỉnh. Thường chỉ căn chỉnh một điểm cho lần tái căn chỉnh, bởi nó sẽ thay đổi vị trí giao điểm (E0) mà không thay đổi độ dốc đã tạo ra bởi căn chỉnh nhiều điểm từ lúc đầu. Nên sử dụng các đệm chứa khoảng pH của mẫu trong việc căn chỉnh, như đã trình bày trong phần trên. <o></o>
<o> </o>
Nên sử dụng máy khuấy từ cho đệm và mẫu với tấm chắn ngăn cách bình chứa và mặt đĩa để ngăn sự truyền nhiệt sinh ra bởi đĩa máy khuấy. Nên sử dụng đệm đầu tiên có pH 7 do máy đo xác định điểm E0.<o></o>
<o> </o>
Nên đo các đệm pH khác theo thứ tự từ nhỏ tới lớn, và rửa điện cực bằng nước khử ion giữa các lần đo để giảm thời gian cân bằng. Nếu pH kế không đo và xác nhận ảnh hưởng của nhiệt độ, nên tự nhập dữ liệu này vào máy đo.<o></o>
<o> </o>
Kiểm tra hiệu lực tiêu chuẩn đệm của bạn. Dung dịch đệm mất dần tác dụng theo thời gian bởi CO2 từ không khí sẽ vào trong bình chứa, tạo carboxylic acid, làm thay đổi giá trị pH và chi phối không gian đệm (cause shifting pH values and consuming buffer capacity). Bằng chứng rõ ràng là bình chứa đệm pH 10 sẽ acid hơn trong vòng vài giờ sau khi mở. Do các yếu tố môi trường thay đổi nên không thể dự đoán tuổi thọ của đệm chuẩn. Do đó những túi đệm sử dụng một lần được sử dụng phổ biến.<o></o>
<o> </o>
Khi đo pH<o></o>
Điện cực phải được đặt ngập trong đệm hay mẫu để làm ngập hoàn toàn cảm biến của điện cực và mối nối. Phải để dung dịch điện cực cao hơn ít nhất 1 inch trên bề mặt mẫu. Nên sử dụng máy khuấy từ cho các đệm và mẫu với tấm chắn cách nhiệt giữa bình chứa và bề mặt máy. Kết quả được lặp lại một cách tốt nhất khi đo đệm và mẫu tại cùng một nhiệt độ. Nên tráng điện cực bằng nước khử ion, vẩy hoặc thấm khô, và tráng tiếp bằng dung dịch cần đo. Không nên sấy khô điện cực bởi sẽ sinh ra điện tĩnh điện trên điện cực và làm giá trị pH hiện lên sẽ biến đổi cho tới khi điện tích này mất đi. Lý tưởng nhất là ghi lại nhiệt độ tất cả các lần đo pH, và nên căn chỉnh sau mẫu cuối cùng để chắc chắn rằng điện cực hoạt động tốt. Nên kiểm tra mẫu kiểm chứng (một đệm pH 5 khi sử dụng máy đo định cỡ pH 4 và 7) rải rác giữa các mẫu.<o></o>

 

[happyfly]

Đo pH trong PTN khác với đo tại hiện trường hay nhà máy như thế nào?<o></o>
Việc đo trên hiện trường không được đảm bảo các điều kiện về môi trường thí nghiệm và thao tác như trong phòng thí nghiệm. Tại đây, người ta đo bằng cách đặt trực tiếp điện cực vào toàn lượng mẫu, thay vì lấy ra một lượng mẫu từ bể lên men. Điều này cũng có nghĩa là phép đo ít được kiểm soát về độ không đồng đều hay độ tương đồng của mẫu, do đó có khả năng không ghi đúng giá trị pH thực. Nên ghi lại nhiệt độ và tiến hành căn chỉnh ngay tại vị trí đo.<o></o>
<o> </o>
Thể tích mẫu có ảnh hưởng tới độ chính xác của phép đo pH hay không?<o></o>
Thông thường, thể tích mẫu tự nó không ảnh hưởng trực tiếp tới độ chính xác pH, nhưng sẽ giảm khả năng lặp lại kết quả nếu không làm ngập cảm biến điện cực và mối nối trong mẫu khi đo. Như đã mô tả trong phần trên, pH có xu hướng thay đổi trong thể tích mẫu nhỏ do ảnh hưởng của CO2 trong không khí. Nhiệt độ và tốc độ tản nhiệt phụ thuộc vào thể tích mẫu, nên tốt nhất là sử dụng cùng lượng mẫu trong mỗi lần đo. Nên tiến hành cùng một việc xử lí cho tất cả các mẫu (như pha loãng hay đo phần dịch nổi); các yếu tố ảnh hưởng càng ít biến đổi, kết quả càng đáng tin cậy. Hệ thống đo tự động sẽ hoạt động tốt nhất khi đo cùng một lượng mẫu như khi giảm điện cực sẽ giảm trong bình chứa có thể tích cố định (Automated sampling systems will operate best with the same volume as the electrode will be lowered into the beaker a fixed amount???.)
<o> </o>
Đo pH của mẫu nhớt, bán rắn, có nồng độ ion thấp, hay lạ?<o></o>
Đo mẫu nhớt và bán rắn tốt nhất nên sử dụng điện cực mối nối fast fllowing flushable hoặc công nghệ FET. Các mối nối flushable thiết kế để dễ lau rửa và sẽ làm mẫu tiếp xúc tốt hơn với dòng nhanh. Có thể lau rửa điện cực cảm ứng FET mà không phải để ý tới các vấn đề phân cực của điện cực thủy tinh. Mẫu có nồng độ ion thấp sẽ đo tốt nhất với điện cực khả tái tạo chứa dung dịch có nồng độ ion thấp.<o></o>
<o> </o>
Khi đo các mẫu lạ, việc căn chỉnh hệ thống với đệm có lực ion tương tự với mẫu sẽ tăng khả năng lặp lại của kết quả. Mẫu có thể tích nhỏ với lực ion thấp có thể bị tác động khi tiếp xúc với không khí. Tỉ lệ diện tích bề mặt và thể tích mẫu trên lượng mẫu càng lớn, khả năng CO2 trộn vào mẫu và thay đổi pH càng lớn. Điều này đã được quan sát trong nước khử tia cực tím và trong protocol kiểm tra nước tiêm USP (USP 645, US Pharmacopeia).
<o> </o>
Làm thế nào để tăng độ bền pH kế?
<o> </o>
Sử dụng đúng<o></o>
Nếu thao tác và đánh giá sản phẩm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất, một máy đo có chất lượng vẫn sẽ làm việc tốt sau nhiều năm sử dụng. Ngoài ra, phải bảo vệ máy đo khỏi các dịch lỏng, lau sạch dịch tràn và sử dụng thận trọng. Nên dùng riêng một máy đo nếu phải thường xuyên sử dụng nó trong môi trường khắc nghiệt. Thí dụ, đối với những công việc trên hiện trường hay trên tàu thì nên áp dụng hệ thống chống thấm phù hợp.<o></o>
<o> </o>
Làm sạch đúng cách<o></o>
Kết tủa tại mối nối điện cực<o></o>
Kết tủa tạo ra tại các mối nối điện cực là Kali Clorua kết tinh từ dung dịch bên trong. KCL này được tạo thành khi dung dịch bên trong chứa KCl đi qua mối nối khi không có mẫu hay dịch lỏng ở phía mặt ngoài của mối nối. Nước bay hơi sẽ làm hình thành tinh thể. Nên rửa KCl kết tinh với nước khử ion và kiểm tra thể tích dung dịch bên trong trước khi sử dụng lại điện cực.<o></o>

 

[happyfly]

Các mối nối điện cực bị tắc<o></o>
Các loại mối nối khác nhau đòi hỏi kĩ thuật làm sạch khác nhau. Hãy tham khảo sách hướng dẫn sử dụng dành riêng cho điện cực của bạn. Thông thường, có thể loại cặn của mẫu bằng cách ngâm hay siêu âm trong dịch rửa thương mại dành cho loại mẫu của bạn hoặc dịch HCl loãng. Sự tích tụ protein thường cần dung dịch rửa chứa pepsin để làm sạch nhanh hơn. Sau khi rửa, nên súc phần buồng điện cực chứa dung dịch bằng lượng dư nước khử ion, sau đó tráng nhiều lần với dung dịch bên trong. Việc tráng này để đảm bảo rằng khi sử dụng điện cực nồng độ dung dịch bên trong không bị pha loãng. Nếu phải rửa mối nối thường xuyên, cần xem xét để đổi một hệ thống chuẩn hoặc một dung dịch khác. Nếu mối nối luôn không thể sạch theo yêu cầu; phải thay thế điệc cực.<o></o>
<o> </o>
Bảo quản đúng cách<o></o>
Bảo quản điện cực đúng theo đề nghị của nhà sản xuất. Nên bảo quản một số điện cực, như điện cực đổ gel trong dung dịch bảo quản pH. Chúng có thể bị hỏng nếu bảo quản khô. Thường bảo quản điện cực khả tái tạo chuẩn với dung dịch bên trong và có đóng nắp. Đậy phần cảm ứng và giữ ẩm bằng dịch bảo quản pH. Có thể thay dung dịch bên trong khi sử dụng lại điện cực. Có thể bảo quản khô một số điện cực mối nối có vỏ cứng (sleeve junction electrodes). Tinh thể có thể xuất hiện khi dung dịch bay hơi, nhưng lại có thể rửa sạch được bằng nước khử ion trước khi sử dụng lại điện cực.<o></o>
<o> </o>
Điện cực khả tái tạo bền bởi chúng được thiết kế để bảo quản và không có một thể tích dung dịch bên trong được cố định mà mức của nó chỉ ra tuổi thọ của sản phẩm. Điện cực gel có một lượng chính xác gel, lượng gel này rò rỉ liên tục và phải thay thế điện cực khi gel hết. Có thể bảo quản khô điện cực FET khả tái tạo và đổ dịch mới trước khi sử dụng. Bất kỳ điện cực nào đều có độ bền phụ thuộc vào việc bảo dưỡng và duy trì, lượng mẫu/số lần sử dụng, loại dung dịch bên trong và lượng dung dịch đó nếu nó không thể thay thế.<o></o>
<o> </o>
Xử lí sự cố<o></o>
Sẽ gặp phải những vấn đề nào?<o></o>
Máy đo<o></o>
Có thể kiểm tra sự thực hiện của riêng máy đo, không kể điện cực. Có thể kiểm tra dễ dàng một pH kế bằng cách dùng một nắp nhỏ trên đầu vào điện cực để cắt kết nối BNC (A quality pH meter can be tested easily by using a shorting cap over the electrode input to shunt or close off the BNC connector). Điều này cho phép máy đo tự kiểm tra dòng điện có hoạt động đúng hay không. Lỗi sẽ hiện nếu máy đo nếu có bất kì kiểm tra nào thất bại. Tham khảo sách hướng dẫn sử dụng cho những phần chi tiết hơn.<o></o>
<o> </o>
Độ dốc<o></o>
Chỉ thị tốt nhất về tình trạng điện cực là độ dốc của đường chuẩn và thời gian đáp ứng để đạt giá trị pH ổn định. Một điện cực sạch, hoạt động tốt sẽ tạo ra độ dốc gần 100% hay 59.16mV/decade (đã giải thích trong phần trước), là độ dốc lí thuyết pH được xác định bởi phương trình Nerst. Theo thời gian sử dụng của điện cực, phần trăm độ dốc giảm. Việc sử dụng và bảo dưỡng điện cực đúng cách có thể làm giảm hiện tượng này. Phổ hoạt động đưa ra nhà sản xuất ít biến đổi nhưng thường từ 92% tới 100% theo tiêu chuẩn lý thuyết trên. Nên thay thế điện cực khi độ dốc giảm xuống dưới phổ hoạt động nhà sản xuất đưa ra.<o></o>

 

[happyfly]

Thời gian đáp ứng (Response time)<o></o>
Thời gian đáp ứng còn gọi là thời gian cần thiết để tín hiệu đạt ổn định. Thời gian này sẽ kéo dài nếu đầu thủy tinh cảm ứng bị thành phần mẫu bao phủ. Có thể khắc phục điều này bằng cách làm sạch và/hoặc thay thế dung dịch bên trong. Sẽ không phục hồi lại được bằng cách lau rửa khi điện cực đã hỏng. Nếu số liệu căn chỉnh sụt trong (calibration data fall within) chi tiết đưa ra bởi nhà sản xuất, bạn có thể đã gặp phải vấn đề do mẫu.<o></o>
<o> </o>
Mẫu có là một vấn đề không?<o></o>
Nếu thấy việc đọc mẫu không phù hợp, hãy đo pH của đệm chuẩn. Nếu đo đúng thì bạn đã gặp vấn đề về mẫu. Nếu điện cực chậm hoặc không ổn định khi đo chuẩn, hãy làm sạch và căn chỉnh lại điện cực. Phân tích lại đệm chuẩn với điện cực đã làm sạch trong đệm để kiểm tra hoạt động của hệ thống. Nếu đã chính xác, đo lại mẫu. Nếu mẫu vẫn không đưa ra giá trị ổn định, hãy kiểm tra thêm về kĩ thuật đo, và bản thân mẫu.<o></o>
<o> </o>
Đôi khi không đạt được giá trị mong đợi là giá trị đúng khi đo. Đơn giản bởi giá trị nhận được sai. Các ion cạnh tranh, ion natri tại pH lớn hơn hoặc bằng 12, hay điện cực bị mẫu bao phủ có thể ảnh hưởng tới phép đo pH. Thủy tinh cảm ứng pH được tối ưu cho ion hydro, nhưng cũng xác định ion natri trong phạm vi nhỏ hơn. Lỗi sinh ra bởi ion natri này tăng theo độ lớn của pH. Có thể chỉnh việc đọc pH trong mẫu có nồng độ natri cao bằng một biểu đồ (nomogram) trong sách hướng dẫn sử dụng điện cực. Các hợp chất hay ion khác có thể phức tạp nhưng không tác động tới dung dịch hoặc liên kết hay thay đổi dạng của nó nên sẽ không ảnh hưởng tới mẫu (Other compounds or ions could be “ complexed ” out of solution or bound up or change its form so that it doesn’t affect the sample any more.).<o></o>
<o> </o>
Thông thường có thể phân tích mẫu tốt hơn nhờ sử dụng thiết kế điện cực khác. Điện cực gel có giá thành vừa phải với mối nối bấc (wick junctions) - nơi mà mẫu có thể đi vào dung dịch gel chuẩn - không đắt như điện cực khả tái tạo trong hệ thống phức tạp. Sử dụng điện cực flushable là tốt nhất đối với mẫu có thể gây nhiễm dung dịch bên trong. Cần lượng mẫu đủ để đưa ra giá trị pH; dễ lặp lại kết quả hơn ở mẫu pha loãng. Nên đo mẫu và đệm tại cùng nhiệt độ nếu có thể. Thành phần mẫu có thể thay đổi theo nhiệt độ. pH là phép đo có tính tương quan, do đó cần tối ưu phương pháp chuẩn bị mẫu của bạn.
<o> </o>
Kĩ sư bảo dưỡng, nhân viên kĩ thuật, hay đại lý bán hàng: ai có thể giúp bạn mà tốn ít chi phí nhất?
<o> </o>
Phép đo điện hóa hoạt độ ion hydro là đơn giản, nhưng phức tạp. Bởi nhiều yếu tố và quá trình tương tác, lỗi trong phép đo tăng theo số lượng người sử dụng. Cách tốt nhất để có kết quả tối ưu là tự học về hệ thống đo của bạn theo hướng dẫn cung cấp bởi nhà sản xuất thiết bị.<o></o>
<o> </o>
Có nhiều loại điện cực pH thủy tinh chuẩn. Hãy đảm bảo rằng bạn đang sử dụng điện cực tốt nhất cho loại mẫu của bạn. Mẫu chỉ được tiếp xúc với điện cực. Do đó, điện cực không hoạt động đúng không thể cho kết quả chính xác. Việc chuẩn bị điện cực và đưa điện cực vào hoạt động là quan trọng và thay đổi theo loại điện cực. Hiểu biết về mẫu sẽ giúp bạn có hệ thống đo và quy trình căn chỉnh phù hợp.<o></o>
<o> </o>
Nếu bạn cần hỗ trợ kĩ thuật khi phân tích, cách tốt nhất là liên hệ với nhà sản xuất điện cực. Bởi khi so sánh với các thiết bị khác trong PTN và điện cực khả tái tạo, giá thành pH kế không phải lớn, kĩ sư bảo dưỡng không phải là sự lựa chọn hiệu quả.<o></o>

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Có thể chỉnh việc đọc pH trong mẫu có nồng độ natri cao bằng một biểu đồ (nomogram) trong sách hướng dẫn sử dụng điện cực. Các hợp chất hay ion khác có thể phức tạp nhưng không tác động tới dung dịch hoặc liên kết hay thay đổi dạng của nó nên sẽ không ảnh hưởng tới mẫu (Other compounds or ions could be “ complexed ” out of solution or bound up or change its form so that it doesn’t affect the sample any more.).<o></o>

nomogram: toán đồ

Các hợp chất hoặc ion khác có thể tạo phức tách khỏi dung dịch, gắn với nhau, hoặc biến dạng......

 

[happyfly]

Máy quang phổ (Michael G.Davies và Andrew T.Dadd)<o></o>
Phần tổng quan này có nêu một số ảnh hưởng cơ bản của quang phổ UV nhìn thấy và tóm tắt một vài quy trình hoạt động chuẩn. Ở đây sẽ cung cấp cho người đọc những bước cơ bản để lựa chọn và điều khiển thiết bị UV/V theo yêu cầu đặc biệt hay thông thường. Phần này cũng đưa ra một số phương pháp gần đây để áp dụng một cách thành công các phân tích định lượng và định tính các phân tử lớn (thí dụ, protein và nucleic acid) và các phân tử nhỏ bao gồm nucleotide, amino acid, hay bất kỳ hợp chất hấp thụ UV/V nào.<o></o>
<o> </o>
Điều gì là quan trọng khi lựa chọn máy quang phổ?
Hầu hết các thiết bị đơn giản (Most entry level instruments) thực hiện được những ứng dụng phổ biến nhất bao gồm phân tích protein và nucleic acid. Thông tin sau đây được cung cấp để giúp bạn lựa chọn thiết bị.

Lượng thể tích mẫu nào mà bạn hay phân tích nhất?<o></o>
Những tiến bộ trong chế tạo cuvette làm cho việc dùng thể tích và sự tập trung bắn phá UV/V thể hiện ở phổ hoặc bước sóng đơn/liên tục trở nên linh động hơn. Trong một số máy, có thể sử dụng cuvette có dung tích (Cell volumes) nhỏ tới 10ml và sẽ cần tới loại đế đặc biệt để giữ cuvette nằm đúng trên đường truyền ánh sáng. Sẽ cung cấp chi tiết hơn về các loại cuvette (cell types) trong phần sau của chương này. Nên lưu ý rằng dòng liên tục cũng như đế giữ cuvette có chỉnh nhiệt chỉ được cung cấp cho những ứng dụng đặc biệt.<o></o>
<o> </o>
Máy tính ngoài (PC)<o></o>
Điều khiển hoạt động bằng máy tính rất có ích để ghi và thu tín hiệu qua đĩa, LIMS (Laboratory Information Management System – Hệ thống quản lí tin học PTN), mạng, và đưa ra thông báo theo yêu cầu. Hầu hết các máy đo quang được quản lí bằng máy tính luôn có nhiều chức năng để phân tích và xử lí tín hiệu. Hầu hết thiết bị di động có thể quét (scan), phân tích động học, định lượng, và nhiều chức năng khác, nhưng bị hạn chế về khả năng lưu trữ và xử lí tín hiệu. Một số nhà sản xuất bán các phần mềm kết nối với máy PC ngoài để mở rộng việc xử lí tín hiệu và các chức năng. Việc liên kết giữa một thiết bị có chi phí thấp và phần mềm hỗ trợ đôi khi lại mang tới nhiều chức năng hơn mà chi phí lại nhỏ hơn. Điều này bù lại bởi tốn không gian và chi phí cho máy tính ngoài.<o></o>
<o> </o>
Chùm tia đơn sắc hay đa sắc (Single Beam or Double Beam) qua mạng diode
Trong máy quang phổ UV-nhìn thấy, có cung cấp ba cấu hình quang học để lựa chọn.
<o></o>
Thiết bị chùm tia đơn sắc với bộ vi điều khiển có độ ổn định cao, cấu hình quang và máy đơn giản. Nguồn ánh sáng là tia đơn sắc (lựa chọn một bước sóng) thường tạo ra bởi cách tử nhiễu xạ (diffraction grating) (hoặc một lăng kính trong các thiết bị loại cũ) và sau đó truyền qua cuvette chứa mẫu. Đối chứng và mẫu so sánh bằng việc đưa tín hiệu của mẫu tới bộ vi xử lí mà đã lưu tín hiệu đối chứng và loại trừ tín hiệu này trước khi hiện kết quả.

Chùm tia trong máy quang phổ chùm tia đa sắc được tách ra và đưa qua cả dung dịch mẫu và đối chứng để thu giá trị trực tiếp do sự khác nhau. Điều này có ích trong các ứng dụng khi mà đối chứng tự thay đổi và việc loại trừ baseline hằng định có thể được sử dụng như việc bù, như đối với phân tích enzyme trong hệ thống sinh học. Trong hệ thống chùm tia đa sắc, ánh sáng gốc được truyền một phần qua mẫu, và cần phải tính tới tương tác giữa ánh sáng và cuvette để thu kết quả chính xác.<o></o>
<o></o>

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Máy quang phổ
<o> </o>

Hầu hết các thiết bị đơn giản (Most entry level instruments)

cuvette có dung tích (Cell volumes)
(Laboratory Information Management System – Hệ thống quản lí tin học PTN),
Chùm tia đơn sắc hay đa sắc (Single Beam or Double Beam)
<o></o>

Máy quang phổ --> quang phổ kế
Most entry level instruments --> đúng rồi
entry level = basic; introductory
Cell volumes --> thể tích giếng
Sẽ cung cấp chi tiết hơn về các loại cuvette (cell types)--> loại giếng
Laboratory Information Management System – Hệ thống quản lí thông tin PTN
Single Beam or Double Beam: một chùm sáng hay hai chùm sáng tới

 

[happyfly]

Cấu hình quang học thứ ba là mạng diode. Sau khi đi qua mẫu, ánh sáng trở thành đơn sắc. Thu và đo ánh sáng này bằng một hệ thống riêng bao gồm các yếu tố phát hiện ?? (DE Detector elements) trong máy đã được chế tạo để thu phổ đầy đủ các bước sóng. Không cần đậy mẫu. Lựa chọn bước sóng bằng DE (xấp xỉ 500 tại 1nm/diode), ở đây có phổ quang học hạn chế hơn so với thiết bị chùm tia đơn hay kép (single beam or double beam).<o></o>
<o> </o>
Phổ bước sóng<o></o>
Nucleic acid và protein cần phổ UV 230-320 nm. Các hợp chất khác có thể được phân tích bởi lựa chọn bước sóng riêng và quét trong phổ nhìn thấy được. Cho tới nay, những thiết bị được phân loại không nhìn thấy (visible only) –(>320nm) hay UV và nhìn thấy được (190–1100nm) cơ bản trên sự phản xạ của công nghệ của bóng (lamp). Với sự phát triển trong thiết kế bóng và công nghệ tách sóng? (detector technology), hệ thiết bị khác có thể điều khiển sự hấp thụ trong khoảng 200-800nm chỉ với một bóng. Những thiết bị gọn nhẹ này hầu hết được thiết kế để đo độ tinh sạch, nồng độ của nucleic acid và protein, và đôi khi cũng có những chức năng quét cơ bản. Cho những nghiên cứu chuyên sâu hay với những phần trọng yếu, nên sử dụng thiết bị có thể quét trong khoảng 190 và 1100nm.<o></o>
<o> </o>
Bước sóng, độ chính xác trắc quang và ánh sánh rải rác/tản mạn (Stray Light)<o></o>
Độ chính xác bước sóng mô tả thay đổi trong bước sóng ánh sáng bạn đặt và bước sóng thực tế máy tạo ra. Trong hầu hết các thiết bị, sai số trong khoảng 0.7 - 2nm. Với thiết bị sai về bước sóng, sai số lớn nhất sẽ quan sát được tại bước sóng ở hai phía của độ hấp thụ lớn nhất của phân tử khi sự hấp thụ với bước sóng tương ứng có tốc độ thay đổi lớn (Hình 4.13) và khi làm việc với dung dịch pha loãng (Should an instrument suffer from wavelength inaccuracy, the largest variation would be observed at wavelengths on either side of the absorbance maximum for a molecule, where there is a large rate of change of absorbance with respect to wavelength (Figure 4.13) and when working with dilute solutions.). Chú ý trong Hình 4.13 về độ hấp thụ giảm mạnh tại bước sóng lớn hơn hoặc bằng 280nm. Bất kỳ sai số nào về bước sóng do thiết bị cũng sẽ tạo ra tín hiệu rất lệch trong phổ hấp thụ của các vùng DNA có thể biến đổi. Hiện tượng này cũng giải thích tại sao phải xử lí thận trọng kết quả A280 của dung dịch rất loãng. <o></o>
<o> </o>
Sự chính xác trắc quang mô tả đường tuyến tính đáp ứng trên phổ hấp thụ. Thông thường điều này được biểu hiện bởi hai phần tử hấp thụ tại bước sóng riêng mà khi đo có dựa trên một loạt các tấm lọc chuẩn đã căn chỉnh bởi các tổ chức như NIST. Điển hình, nó sẽ nằm trong khoảng 0.5%. Như hầu hết bộ tách sóng ánh sáng thường chính xác tới 1%, yếu tố chính ảnh hưởng tới độ chính xác là lỗi truyền ánh sáng, phổ biến nhất là dạng ánh sáng tản mạn. Ánh sáng tản mạn là bức xạ phát ra từ máy phát đơn sắc hơn là từ máy đa sắc (máy mà có thể lựa chọn bước sóng). Ánh sáng bổ sung làm cho giá trị hấp thụ được đo thấp hơn giá trị thực, tạo ra sai số âm từ quy luật Beer-Lambert (Biochrom Ltd., 1997), cuối cùng sẽ làm mất độ tin cậy khi xác định nồng độ. Ánh sáng tản mạn có ảnh hưởng tương đối lớn khi độ hấp thụ mẫu cao, như khi đo DNA nồng độ lớn tại 260nm. Loại đi ảnh hưởng này bằng cách pha loãng mẫu hay sử dụng giếng có đường truyền ánh sáng ngắn hơn (smaller path length cell).<o></o>
<o> </o>
Độ phân giải của độ rộng dải tần quang phổ<o></o>
Độ phân giải độ rộng dải tần mô tả khả năng quang phổ kế phân biệt được đỉnh hấp thụ hẹp. Độ rộng dải tần tự nhiên của một phân tử được xác định bằng độ rộng của đường cong hấp thụ tại mức bằng một nửa mức hấp thụ cao nhất, từ 5 tới 50nm cho hầu hết các phân tử. Độ rộng dải tần DNA là 51nm, khi đo với phổ trong Hình 4.13. Người ta chỉ ra rằng nếu tỉ lệ của độ rộng phổ thực tế và tự nhiên (spectral to natural bandwidth) lớn hơn 1:10, sự hấp thụ đo bởi quang phổ kế đã có sai số lớn. Quang phổ kế có độ rộng dải tần cố định nhỏ hơn hay bằng 5nm là lí tưởng cho các polymer sinh học do không cần chính xác tới từng chi tiết (no fine spectral detail). Phải cần độ phân giải cao với các mẫu có đỉnh nhọn như dung môi hữu cơ, các nguyên tố chuyển tiếp transition elements, và chất bay hơi như benzene và styrene.<o></o>
<o> </o>
Quy chuẩn Phòng thí nghiệm (Good Laboratory Practice (GLP))<o></o>
Các yêu cầu về phòng thí nghiệm ngày càng được nâng cao để phù hợp với kĩ thuật Good Laboratory Practice (GLP) theo quy định của FDA (1979). FDA yêu cầu phải kết quả phải được lưu lại trong thiết bị và chứng minh được thiết bị hoạt động tốt. European Pharmacopoeia (1984) đã đưa ra những yếu tố quan trọng đối với hoạt động của quang phổ kế như độ rộng dải tần quang phổ, ánh sáng tản mạn, độ chính xác trong hấp thụ và bước sóng. Người ta đưa ra các bài kiểm tra chuẩn và thực hiện với tấm lọc và dung dịch phù hợp để đảm bảo cho hoạt động của thiết bị.<o></o>

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Cho tới nay, những thiết bị được phân loại không nhìn thấy (visible only) –(>320nm) hay UV và nhìn thấy được (190–1100nm) cơ bản trên sự phản xạ của công nghệ của bóng (lamp). Với sự phát triển trong thiết kế bóng và công nghệ tách sóng? (detector technology),

Bước sóng, độ chính xác trắc quang và ánh sánh rải rác/tản mạn (Stray Light)<o></o>
Với thiết bị sai về bước sóng, sai số lớn nhất sẽ quan sát được tại bước sóng ở hai phía của độ hấp thụ lớn nhất của phân tử khi sự hấp thụ với bước sóng tương ứng có tốc độ thay đổi lớn (Hình 4.13) và khi làm việc với dung dịch pha loãng (Should an instrument suffer from wavelength inaccuracy, the largest variation would be observed at wavelengths on either side of the absorbance maximum for a molecule, where there is a large rate of change of absorbance with respect to wavelength (Figure 4.13) and when working with dilute solutions.).
<o> </o><o></o>
Độ rộng dải tần DNA là 51nm, khi đo với phổ trong Hình 4.13. Người ta chỉ ra rằng nếu tỉ lệ của độ rộng phổ thực tế và tự nhiên (spectral to natural bandwidth) lớn hơn 1:10, sự hấp thụ đo bởi quang phổ kế đã có sai số lớn. Quang phổ kế có độ rộng dải tần cố định nhỏ hơn hay bằng 5nm là lí tưởng cho các polymer sinh học do không cần chính xác tới từng chi tiết (no fine spectral detail). Phải cần độ phân giải cao với các mẫu có đỉnh nhọn như dung môi hữu cơ, các nguyên tố chuyển tiếp transition elements, và chất bay hơi như benzene và styrene.<o></o>
<o> </o>
Quy chuẩn Phòng thí nghiệm (Good Laboratory Practice (GLP))<o></o>

visible only = chỉ trong vùng nhìn thấy/khả kiến

detector technology = công nghệ chế tạo bộ phát hiện/detector

Nếu thiết bị mắc lỗi về bước sóng thì sẽ quan sát thấy biến đổi lớn nhất tại bước sóng ở hai biên độ hấp thụ cực đại của phân tử (do khi đó tỷ lệ thay đổi độ hấp thụ trên bước sóng là lớn) (Hình 4.13) và khi làm việc với dung dịch pha loãng (Should an instrument suffer from wavelength inaccuracy, the largest variation would be observed at wavelengths on either side of the absorbance maximum for a molecule, where there is a large rate of change of absorbance with respect to wavelength (Figure 4.13) and when working with dilute solutions.)

Spectral Bandwidth Resolution = độ phân giải của dải tần quang phổ

It can be shown that if the ratio of spectral to natural bandwidth is greater
than 1 : 10 = có thể thấy rằng nếu tỷ lệ dải tần quang phổ trên dải tần tự nhiên lớn hơn 1:10...

since there is no fine spectral detail = do có chi tiết phổ rộng

sharp peaks = đỉnh hẹp

Good Laboratory Practice = thực hành phòng thí nghiệm tốt

 

[happyfly]

Chỉ thị tốt nhất của một thiết bị đang hoạt động tốt là gì ngoài việc tự kiểm tra bởi quang phổ kế?<o></o>
<o> </o>
Đường hướng thực hiện<o></o>
Hãy đo các mẫu chuẩn trong thiết bị của bạn và bằng quang phổ kế khác nếu có thể. Hãy sử dụng tấm lọc hấp thụ căn chỉnh bởi NIST và các tổ chức thương mại (Corion Corporation, Franklin, MA; the National Physical Laboratory, Teddington. London; and Starna, Hainault, U.K.). Người ta cung cấp dung dịch nucleic acid đã được định lượng (Gensura Corporation,San Diego,CA) nhưng chú ý rằng dung dịch này mất dần hiệu lực theo thời gian dài. Nucleic acid và protein chuẩn được cung cấp dưới dạng rắn theo yêu cầu nên phải xác định nồng độ cẩn thận khi sử dụng. Không dựa vào lượng ghi trên nhãn sản phẩm để xác định lượng bên trong.<o></o>
<o> </o>
Đường hướng có tính chứng thực<o></o>
Các tổ chức chuẩn quốc gia và quốc tế sẽ có các yêu cầu tương tự như trong các kiểm tra sau.<o></o>
Độ rộng dải tần/Độ phân giải<o></o>
Kiểm tra phía ngoài theo một cách phổ biến là bài kiểm tra của Pharmacopoeia (European Pharmacopeia, 1984). Theo European Pharmacopoeia (2000) là xác định tỉ lệ độ hấp thụ tại 269 và 266nm trong dung dịch 0.02% v/v toluene R trong hexane R. (R: reagent grade-cấp chất phản ứng. Đối với các hóa chất, người ta phân loại hóa chất dựa theo độ tinh sạch. R: Cấp chất phản ứng: chất sử dụng để phân tích và có độ tinh sạch rất cao. Ngoài ra còn có Industrial Grade, Pharmaceutical Grade… ) <o></o>
<o> </o>
Ánh sáng tản mạn<o></o>
Ánh sáng tản mạn được xác định nhờ sử dụng một tấm lọc chỉ cho tia sáng có bước sóng lớn hơn một mức nào đó đi qua và ngăn tất cả tia có bước sóng nhỏ hơn. Bất cứ sự truyền đo được nào sau đó đều phụ thuộc vào ánh sáng tản mạn. European Pharmacopoeia (2000) đã chỉ rõ rằng độ hấp thụ của Kali Chloride R nên lớn hơn 2.0 tại 200nm, khi sử dụng nước R làm dung dịch chuẩn.<o></o>
<o> </o>
Độ chính xác bước sóng<o></o>
Điều này được xác định bằng cách sử dụng chuẩn có đỉnh hẹp tại vị trí đã biết. Theo European Pharmacopoeia (2000), có thể sử dụng giá trị hấp thụ cực đại của dung dịch holmium perchlorate, đường (line) hydro hay đèn ống phóng điện deuterium, hoặc đường hồ quang hơi thủy ngân để định vị bước sóng.
<o> </o>
Lặp lại bước sóng<o></o>
Việc lặp lại bước sóng được thực hiện bằng cách quét lại một đỉnh nhọn tại vị trí đã biết, sử dụng chuẩn tương tự như trong độ chính xác bước sóng.
<o> </o>
Độ chính xác hấp thụ (Đường trắc quang)<o></o>
Khi đo phổ hấp thụ tại một bước sóng yêu cầu, sử dụng các tấm lọc thủy tinh có mật độ trung bình (neutral density glass filters) có chứng nhận của NIST, NPL (National Physical Laboratory) www.nist.gov, www.physics.nist.gov hoặc các quy chuẩn quốc tế khác. Tấm lọc mật độ trung bình hấp thụ rất ổn định trong bước sóng xác định tại vùng nhìn thấy, nhưng cần sử dụng tấm lọc kim loại trên thạch anh hay dịch chuẩn như potassium dichromate Rin pha trong sulphuric acid R (European Pharmacopoeia, 2000) cho các phép đo trong UV. Tấm lọc kim loại trên thạch anh có thể gây ra các vấn đề phản xạ và vỏ kim loại dễ nhiễm bẩn. Phải chuẩn bị dịch cho mỗi lần sử dụng; thị trường có cung cấp lọ chứa potassium dichromate kín và đã được chuẩn bị dưới khí argon.<o></o>
<o> </o>

 

[happyfly]

Khả năng lặp trắc quang (Photometric Reproducibility)<o></o>
Xác định khả năng lặp trắc quang bằng cách đo nhiều lần qua tấm lọc mật độ trung bình.<o></o>
<o> </o>
Nhiễu, độ ổn định, và độ phẳng của baseline<o></o>
Xác định nhiễu bằng cách đo nhiều lần phổ của không khí (không đặt cuvette trên đường truyền sáng) tại độ hấp thụ 0, đặt không khí làm đối chứng. Đây là giá trị RMS (root mean square – căn bậc 2 tổng bình phương) tại một bước sóng nào đó.
<o> </o>
Độ ổn định là sự khác nhau giữa độ hấp thụ cực đại và cực tiểu tại một bước sóng đặc trưng (tại một nhiệt độ cố định ). RMS (square root of [a1^2+ a2^2 + a3^2 + ...], trong đó a là giá trị hấp thụ tại mỗi bước sóng ) được tính từ toàn bộ phổ bước sóng của thiết bị để ra phổ của không khí để xác định đường baseline.<o></o>
<o> </o>
Cuvette nào là phù hợp nhất với nhu cầu của bạn?<o></o>
Thể tích nhỏ<o></o>
Cuvette với thể tích nhỏ nhất lớn hơn hoặc bằng 250ml thường không cần các hộp bảo vệ chuyên dụng và phù hợp với hầu hết các thiết bị. Cuvette với thể tích mẫu nhỏ nhất trong khoảng 100 và 250 ml thường cần hộp bảo vệ chuyên dụng từ lúc sản xuất, và những cuvette có thể tích mẫu dưới 100ml thường luôn cần hộp riêng biệt mà khó có thể trao đổi giữa các nhà sản xuất. Những cuvette có thể tích siêu nhỏ có cửa soi mẫu rất nhỏ (2x2mm) thường đòi hỏi hộp giữ chuyên dụng để đặt cửa sổ này thẳng với chùm sáng tới. Một số nhà sản xuất khuyên nên sử dụng loại giếng có che chắn (masked cells) để giảm sự phân tán ánh sáng.<o></o>
<o> </o>
Nếu độ dài đường truyền sáng của cuvette nhỏ hơn 10mm, hãy kiểm tra thiết bị có tự động tính đến điều này khi chuyển tín hiệu hấp thụ sang nồng độ hay không. Phương trình Beer-Lambert áp dụng độ dài đường truyền sáng là 10mm. Mẫu DNA mạch kép có độ hấp thụ tại 260nm là 0.5 trong cuvette có đường truyền sáng 10mm cho kết quả nồng độ 25mg/ml. Mẫu tương tự trong cuvette với độ dài đường truyền sáng 5mm tạo ra độ hấp thụ 0.25, và nồng độ tương ứng 12.5 mg/ml nếu quang phổ kế không tính đến sự thay đổi về độ dài đường truyền sáng của cuvette. Ống có độ dài đường truyền sáng 0.5 mm có thể dùng để phân tích các mẫu nồng độ cao mà không pha loãng, nhưng có thể ảnh hưởng tới khả năng lặp lại kết quả định lượng do đường truyền sáng quá ngắn.<o></o>
<o> </o>
Cuvette dùng một lần (Disposable Cuvettes)<o></o>
Không nên sử dụng cuvette nhựa (plastic) cho các phép đo định lượng bằng UV do khả năng truyền giảm khi bước sóng dưới 380nm, mà điều này có thể ảnh hưởng nghiêm trọng tới độ chính xác và độ nhạy của phương pháp định lượng. Có thể thay cuvette polystyrene bằng loại có tính methacrylate để ánh sáng truyền tốt hơn so với các cuvette nhựa thông thường. Người ta cũng đang phát triển cuvette được làm từ polymer tổng hợp mới có đặc tính siêu hấp thụ. Tuy nhiên, nên kiểm tra thử để xem nó có phản ứng hay bị hòa tan không khi đo bất kỳ chất nào.<o></o>

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Chỉ thị tốt nhất của một thiết bị đang hoạt động tốt là gì ngoài việc tự kiểm tra bởi quang phổ kế?<o></o>
<o> </o>
Đường hướng thực hiện<o></o>
Hãy đo các mẫu chuẩn trong thiết bị của bạn và bằng quang phổ kế khác nếu có thể. Hãy sử dụng tấm lọc hấp thụ căn chỉnh bởi NIST và các tổ chức thương mại (Corion Corporation, Franklin, MA; the National Physical Laboratory, Teddington. London; and Starna, Hainault, U.K.). Người ta cung cấp dung dịch nucleic acid đã được định lượng (Gensura Corporation,San Diego,CA) nhưng chú ý rằng dung dịch này mất dần hiệu lực theo thời gian dài. Nucleic acid và protein chuẩn được cung cấp dưới dạng rắn theo yêu cầu nên phải xác định nồng độ cẩn thận khi sử dụng. Không dựa vào lượng ghi trên nhãn sản phẩm để xác định lượng bên trong.<o></o>
<o> </o>
Đường hướng có tính chứng thực<o></o>
Các tổ chức chuẩn quốc gia và quốc tế sẽ có các yêu cầu tương tự như trong các kiểm tra sau.<o></o>
Độ rộng dải tần/Độ phân giải<o></o>
Kiểm tra phía ngoài theo một cách phổ biến là bài kiểm tra của Pharmacopoeia (European Pharmacopeia, 1984). Theo European Pharmacopoeia (2000) là xác định tỉ lệ độ hấp thụ tại 269 và 266nm trong dung dịch 0.02% v/v toluene R trong hexane R. (R: reagent grade-cấp chất phản ứng. Đối với các hóa chất, người ta phân loại hóa chất dựa theo độ tinh sạch. R: Cấp chất phản ứng: chất sử dụng để phân tích và có độ tinh sạch rất cao. Ngoài ra còn có Industrial Grade, Pharmaceutical Grade… ) <o></o>
<o> </o>
Ánh sáng tản mạn<o></o>
Ánh sáng tản mạn được xác định nhờ sử dụng một tấm lọc chỉ cho tia sáng có bước sóng lớn hơn một mức nào đó đi qua và ngăn tất cả tia có bước sóng nhỏ hơn. Bất cứ sự truyền đo được nào sau đó đều phụ thuộc vào ánh sáng tản mạn. European Pharmacopoeia (2000) đã chỉ rõ rằng độ hấp thụ của Kali Chloride R nên lớn hơn 2.0 tại 200nm, khi sử dụng nước R làm dung dịch chuẩn.<o></o>
<o> </o>
Độ chính xác bước sóng<o></o>
Điều này được xác định bằng cách sử dụng chuẩn có đỉnh hẹp tại vị trí đã biết. Theo European Pharmacopoeia (2000), có thể sử dụng giá trị hấp thụ cực đại của dung dịch holmium perchlorate, đường (line) hydro hay đèn ống phóng điện deuterium, hoặc đường hồ quang hơi thủy ngân để định vị bước sóng.
<o> </o>
Lặp lại bước sóng<o></o>
Việc lặp lại bước sóng được thực hiện bằng cách quét lại một đỉnh nhọn tại vị trí đã biết, sử dụng chuẩn tương tự như trong độ chính xác bước sóng.
<o> </o>
Độ chính xác hấp thụ (Đường trắc quang)<o></o>
Khi đo phổ hấp thụ tại một bước sóng yêu cầu, sử dụng các tấm lọc thủy tinh có mật độ trung bình (neutral density glass filters) có chứng nhận của NIST, NPL (National Physical Laboratory) www.nist.gov, www.physics.nist.gov hoặc các quy chuẩn quốc tế khác. Tấm lọc mật độ trung bình hấp thụ rất ổn định trong bước sóng xác định tại vùng nhìn thấy, nhưng cần sử dụng tấm lọc kim loại trên thạch anh hay dịch chuẩn như potassium dichromate Rin pha trong sulphuric acid R (European Pharmacopoeia, 2000) cho các phép đo trong UV. Tấm lọc kim loại trên thạch anh có thể gây ra các vấn đề phản xạ và vỏ kim loại dễ nhiễm bẩn. Phải chuẩn bị dịch cho mỗi lần sử dụng; thị trường có cung cấp lọ chứa potassium dichromate kín và đã được chuẩn bị dưới khí argon.<o></o>
<o> </o>

potassium dichromate = kali dichromate

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Khả năng lặp trắc quang (Photometric Reproducibility)<o></o>
Xác định khả năng lặp trắc quang bằng cách đo nhiều lần qua tấm lọc mật độ trung bình.<o></o>
<o> </o>
Nhiễu, độ ổn định, và độ phẳng của baseline<o></o>
Xác định nhiễu bằng cách đo nhiều lần phổ của không khí (không đặt cuvette trên đường truyền sáng) tại độ hấp thụ 0, đặt không khí làm đối chứng. Đây là giá trị RMS (root mean square – căn bậc 2 tổng bình phương) tại một bước sóng nào đó.
<o> </o>
Độ ổn định là sự khác nhau giữa độ hấp thụ cực đại và cực tiểu tại một bước sóng đặc trưng (tại một nhiệt độ cố định ). RMS (square root of [a1^2+ a2^2 + a3^2 + ...], trong đó a là giá trị hấp thụ tại mỗi bước sóng ) được tính từ toàn bộ phổ bước sóng của thiết bị để ra phổ của không khí để xác định đường baseline.<o></o>
<o> </o>
Cuvette nào là phù hợp nhất với nhu cầu của bạn?<o></o>
Thể tích nhỏ<o></o>
Cuvette với thể tích nhỏ nhất lớn hơn hoặc bằng 250ml thường không cần các hộp bảo vệ chuyên dụng và phù hợp với hầu hết các thiết bị. Cuvette với thể tích mẫu nhỏ nhất trong khoảng 100 và 250 ml thường cần hộp bảo vệ chuyên dụng từ lúc sản xuất, và những cuvette có thể tích mẫu dưới 100ml thường luôn cần hộp riêng biệt mà khó có thể trao đổi giữa các nhà sản xuất. Những cuvette có thể tích siêu nhỏ có cửa soi mẫu rất nhỏ (2x2mm) thường đòi hỏi hộp giữ chuyên dụng để đặt cửa sổ này thẳng với chùm sáng tới. Một số nhà sản xuất khuyên nên sử dụng loại giếng có che chắn (masked cells) để giảm sự phân tán ánh sáng.<o></o>
<o> </o>
Nếu độ dài đường truyền sáng của cuvette nhỏ hơn 10mm, hãy kiểm tra thiết bị có tự động tính đến điều này khi chuyển tín hiệu hấp thụ sang nồng độ hay không. Phương trình Beer-Lambert áp dụng độ dài đường truyền sáng là 10mm. Mẫu DNA mạch kép có độ hấp thụ tại 260nm là 0.5 trong cuvette có đường truyền sáng 10mm cho kết quả nồng độ 25mg/ml. Mẫu tương tự trong cuvette với độ dài đường truyền sáng 5mm tạo ra độ hấp thụ 0.25, và nồng độ tương ứng 12.5 mg/ml nếu quang phổ kế không tính đến sự thay đổi về độ dài đường truyền sáng của cuvette. Ống có độ dài đường truyền sáng 0.5 mm có thể dùng để phân tích các mẫu nồng độ cao mà không pha loãng, nhưng có thể ảnh hưởng tới khả năng lặp lại kết quả định lượng do đường truyền sáng quá ngắn.<o></o>
<o> </o>
Cuvette dùng một lần (Disposable Cuvettes)<o></o>
Không nên sử dụng cuvette nhựa (plastic) cho các phép đo định lượng bằng UV do khả năng truyền giảm khi bước sóng dưới 380nm, mà điều này có thể ảnh hưởng nghiêm trọng tới độ chính xác và độ nhạy của phương pháp định lượng. Có thể thay cuvette polystyrene bằng loại có tính methacrylate để ánh sáng truyền tốt hơn so với các cuvette nhựa thông thường. Người ta cũng đang phát triển cuvette được làm từ polymer tổng hợp mới có đặc tính siêu hấp thụ. Tuy nhiên, nên kiểm tra thử để xem nó có phản ứng hay bị hòa tan không khi đo bất kỳ chất nào.<o></o>

Photometric: nên dịch là đo quang hay trắc quang nhỉ?
root mean square = trung bình toàn phương
square root = căn bậc hai
baseline = đường nền
masked cells: chưa nghĩ ra từ nào hay hơn.

 

[happyfly]

Thế nào là cuvette sạch?<o></o>
Cuvette bẩn có gây ra các tín hiệu sai, bởi chúng chứa bóng khí hay còn dính mẫu. Nên rửa cuvette làm từ kính quang học hay thạch anh bằng chất tẩy dành cho kính hay acid loãng(ví dụ HCl có nồng độ nhỏ hơn 0.1M), không sử dụng kiềm bởi sẽ ăn mặt kính. Nếu dùng chất tẩy vẫn không sạch, trước hết hãy kiểm tra cuvette của bạn. Nếu nó là khối thủy tinh hay thạch anh và bạn không nhìn thấy vạch nối nào bên trong cuvette, bạn có thể rửa nó trong nitric hoặc sulfochromic acid đặc (trừ HF) một lúc. Sau đó phải rửa cuvette bằng rất nhiều nước với dụng cụ đặc biệt để phun nước vào trong giếng. Hạn chế thời gian ngâm trong acid đặc do sẽ làm phá hủy bề mặt của cuvette. Để loại bỏ các chất khó tẩy nên sử dụng dung môi phân cực. Một số nhà sản xuất cuvette cung cấp dịch rửa mà họ khẳng định rằng nó phù hợp với mọi trường hợp (Hellmanex, Hellma, Southend, U.K.). Vạch/mối nối chỉ ra chỗ gắn trong sản phẩm và thường có trong cuvette thể tích nhỏ. Có thể xử lí buồng chứa mẫu của cuvette có vạch nối bằng acid nhưng không dùng cho riêng mối nối. Nên xử lí cuvette làm từ các vật liệu và hợp chất không phải thủy tinh theo quy trình phù hợp với độ bền hóa học của chúng.<o></o>
<o> </o>
Tối đa khả năng lặp lại và độ chính xác của tín hiệu như thế nào?<o></o>
Hiểu nhu cầu của bạn<o></o>
Tín hiệu của bạn là định lượng tuyệt đối hay tương đối? Nếu cần định lượng tuyệt đối, giá trị lý tưởng của độ hấp thụ là nằm trên đường căn chỉnh chuẩn. Pha loãng mẫu nếu độ hấp thụ nằm phía trên đường chuẩn, hay chọn cuvette khác có đường truyền sáng ngắn hơn. Nếu giá trị độ hấp thụ nằm phía dưới đường chuẩn và bạn không thể cô đặc mẫu, hãy thêm vào phần đường chuẩn bổ sung (tới đường chuẩn gốc) mà tương tự với phổ nồng độ của mẫu. Điều này sẽ bù vào đường chuẩn những giá trị nằm phía ngoài. <o></o>
<o> </o>
Hiểu mẫu của bạn<o></o>
Chất nhiễm có thể là các chất nào? Bạn có đang sử dụng phenol hay chloroform để chuẩn bị DNA? Có thể mảnh kính vỡ từ kit tinh sạch còn sót lại trong mẫu của bạn? (Could the crushed glass from your purification kit be leaking out with your final product?) Nếu bạn có thể đoán được các chất nhiễm như trên, hãy sử dụng phương pháp để loại bỏ chúng như mô tả trong Chương 7, “Tinh sạch DNA” và chương 8, “Tinh sạch RNA”.
<o> </o>
Nhiều quang phổ kế cũng có thể bù nhiễm bằng cách dùng đối chứng hoặc phép đo 3 điểm chuẩn (3-point net measurements). Nếu bạn không thể đoán được loại nhiễm, quét mẫu qua toàn bộ phổ nhìn thấy UV, và so sánh tín hiệu với mẫu kiểm chứng sạch. Sẽ nhận ra loại chất gây nhiễu bởi bước sóng hấp thụ cực đại sẽ đưa ra tính chất của những nhóm chức cụ thể. Những thông tin này được cung cấp bởi Silverstein và cs (1967). Có thể xác định chất nhiễm bằng cách so sánh đỉnh hấp thụ đặc biệt theo atlas về tín hiệu phổ tham khảo (thí dụ, cung cấp thương mại bởi Sadtler, Philadelphia, PA). Tuy nhiên, tín hiệu tham khảo đôi khi không phù hợp. Chính xác hơn và có liên quan hơn là khai thác thuộc tính của quang phổ kế quét nhanh (fast scanning spectrophotometer) và có phổ của những chất sử dụng khi chuẩn bị mẫu. Điều này có thể đưa ra sự so sánh trực tiếp trên cùng một thiết bị. Cùng với việc sử dụng máy tính để thu kết quả, đây là cách thuận tiện để xây dựng những mô tả về mẫu (sample profiles) để dễ tìm kiếm và thay thế (overlays).<o></o>
<o> </o>
Đo huyền phù tế bào tại 600nm (A600) là phương pháp thuận tiện khi kiểm tra sự phát triển vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy. Khi độ hấp thụ không vượt quá 1.5 đơn vị, A600 tỷ lệ với lượng tế bào (Sambrook et al., 1989). Cấu trúc hình học hệ thống quang của thiết bị ảnh hưởng tới độ lớn của độ hấp thụ do sự phân tán ánh sáng, do đó giá trị A600 có thể khác nhau giữa các thiết bị.<o></o>

 

[cuncon]

Anh Hưng à, em đăng kí vào diễn đàn muộn nên việc dịch tài liệu (cuốn MOLECULAR BIOLOGY PROBLEM SOLVER ) em không tiếp cận được. Giờ chắc các anh chị dịch xong rồi. Nếu có thể anh cho em xin bản dịch và bản gốc nhé,được chương nào tốt chương ấy anh nhé. Em cám ơn anh nhiều. Email cua em lonsua8088@yahoo.com. Chúc anh năm mới hạnh phúc nhé.

 

[happyfly]

Những mẫu rắn, đục hay khó để ánh sáng truyền qua có thể chặn hay làm phân tán ánh sáng, từ đó hạn chế sự chính xác của đáp ứng đo. Hệ thống quang cần cấu hình đặc biệt khi xử lý những mẫu này để có thể để xác định được độ phản xạ, biểu hiện độ hấp thụ. Điều này lại đòi hỏi thiết kế đặc biệt từ ban đầu và dụng cụ thao tác mẫu, và giá thành của chúng có thể lớn hơn quang phổ kế.<o></o>
<o> </o>
Hiểu được giới hạn trong thiết bị của bạn<o></o>
Các thiết bị có giá tầm 10 ngàn $ có thể tạo được tín hiệu là độ hấp thụ có khả năng lặp lại trong khoảng 0.001 - 0.01, nhưng thiết bị trong hầu hết các phòng thí nghiệm đều không làm được điều này. Mẫu siêu loãng phân tích tốt hơn khi sử dụng giếng có đường truyền sáng dài hoặc bộ điều khiển độ dài sóng cố định đặc hiệu cao (fixed wavelength monitor of high specification). Cuvette có thể tích mẫu nhỏ có thể làm giảm hoặc loại trừ yêu cầu phải pha loãng mẫu.
<o> </o>
Thiết bị có khả năng tạo ra độ hấp thụ có thể lặp lại được có giá trị nhỏ tới mức nào? Hãy tạo một đường chuẩn để trả lời câu hỏi này. Chú ý rằng có thể tạo ra giá trị độ hấp thụ có khả năng lặp lại, nhưng nếu không nằm trên đường chuẩn, nó có thể không tương ứng với nồng độ.
<o> </o>
Điều gì góp phần tạo ra tín hiệu A260 và A280 không chính xác?<o></o>
<o> </o>
Các vấn đề về thiết bị<o></o>
Những bóng UV lâu năm, yếu có thể tạo ra tín hiệu không chính xác, cũng như một bóng deuterium mới không cung cấp nhiệt đúng cách (các thiết bị cũ cần 20-40 phút). Các thiết bị được sản xuất trong vòng 10 năm thì khởi động không phải là một vấn đề, nhưng thường phải mất 10 phút và có thể cần thêm tự căn chỉnh (yêu cầu khi làm GLP). Sẽ trình bày về chức năng bóng chi tiết hơn trong phần sau.<o></o>
<o> </o>
Nồng độ mẫu<o></o>
Phép đo mẫu pha loãng gần với giới hạn độ nhạy của quang phổ kế thường gây ra vấn đề đặc biệt đối với các giá trị A280.<o></o>
Sự thay đổi đột ngột (sharp changes- đột ngột, sắc nét…?) ở lân cận của 280nm (Hình 4.13) làm tăng độ sai lệch của độ hấp thụ (amplify any absorbance inaccuracy).
<o> </o>
Các chất nhiễm<o></o>
Muối, dung môi hữu cơ, và protein nhiễm có thể làm tăng độ hấp thụ thực có khi đo tại 260nm. Có thể kiểm tra chất nhiễm và đôi khi định lượng được bằng cách đo độ hấp thụ tại bước sóng xác định. Xác định ảnh hưởng dư trên phổ bằng cách đổi tỉ lệ hấp thụ liên quan (relevant absorbance ratio) (A11/A12) như trong hình 4.14.<o></o>
<o> </o>
Độ hấp thụ tại 230nm<o></o>
Có thể xác định độ hấp thụ của Tris, EDTA, và muối đệm khác khi đo tại 230nm do nucleotide và ribonucleotide thường có độ hấp thụ nhỏ nhất tại vùng ánh sáng này. Vùng 230 nm cũng gần với cực đại hấp thụ của liên kết peptide nên sẽ chỉ ra sự có mặt của protein. Do đó, giá trị thu được tại 230nm hoặc ở vùng lân cận chỉ ra khả năng nhiễm trong quá trình chuẩn bị nucleic acid. Giá trị hấp thụ cao tại 230nm chỉ ra độ tinh sạch đáng ngờ của mẫu nucleic acid. Khi chuẩn bị RNA mà có sử dụng guanidine thiocyanate, mẫu tách nên có tỉ lệ A260/A230 lớn hơn 2. Tỉ lệ thấp hơn thường chứng tỏ rằng mẫu đã bị nhiễm với guanidine thiocyanate trong quá trình chuẩn bị.<o></o>
<o> </o>
Độ hấp thụ tại 320nm<o></o>
Nucleic acid và protein gần như không hấp thụ tại 320nm, mặc dù sự hấp thụ trong khoảng 300 và 350 nm có thể biểu hiện cho kết tủa trong trường hợp của protein. Việc trừ đi độ hấp thụ tại 320nm từ độ hấp thụ tại 260nm có thể loại đi sự hấp thụ do nhiễm chloroform, ethanol, acetate, citrate và những hạt gây đục. Độ hấp thụ nền tại 320 nm gần như làm lệch các giá trị A260 của dung dịch nucleic acid loãng hoặc của các mẫu trong cuvette có thể tích rất nhỏ.<o></o>
<o> </o>
Độ hấp thụ có luôn tỉ lệ tương ứng với nồng độ hay không?<o></o>
Quy luật Beer-Lambert (Biochrom Ltd.,1997) đưa ra quan hệ trực tiếp giữa nồng độ chất, như nucleic acid và protein, và độ hấp thụ của chúng. Do đó biểu đồ về độ hấp thụ theo nồng độ sẽ là đường thẳng đi qua gốc. Khi đường đồ thị thẳng (in straight line conditions), có thể xác định nồng độ chưa biết của mẫu từ giá trị hấp thụ của nó và giá trị hấp thụ của nồng độ nucleic acid và protein đã biết (hoặc một yếu tố căn chỉnh tương ứng khác-an appropriate calibration factor).<o></o>
<o> </o>
Khi đường biểu thị độ hấp thụ và nồng độ theo quy luật Beer-Lambert không thẳng, không thể đo chính xác DNA và protein mà chỉ sử dụng một yếu tố (như độ hấp thụ phân tử - molar extinction coefficient or molar absorptivity http://en.wikipedia.org/wiki/Molar_absorptivity) hay nồng độ để căn chỉnh. Để chính xác nhất, phải căn chỉnh giá trị hấp thụ với những nồng độ đã biết mà tương ứng với nồng độ mẫu. Phổ chuẩn căn chỉnh nên chứa nồng độ mẫu, những nồng độ này được đo để bù một cách phù hợp cho những giá trị ngoài đáp ứng đường chuẩn. Sự lệch ra khỏi đường thẳng là do ba ảnh hưởng chính sau trong quá trình thí nghiệm: thay đổi trong sự hấp thụ ánh sáng, tác động của thiết bị, và thay đổi về hóa tính.<o></o>
<o> </o>
Những thay đổi trong hấp thụ ánh sáng được tạo ra do những tác động lên chỉ số khúc xạ trong dung dịch trong khi đo. Chỉ số này không đổi trong dung dịch có nồng độ thấp nhưng lại có thể thay đổi khi nồng độ muối đệm trên 0.001M. Điều này không ảnh hưởng tới quá trình định lượng bởi có thể căn chỉnh phép đo bằng hệ dung dịch chuẩn (bracketing standard solutions) hay đường chuẩn.<o></o>
<o> </o>
Những ảnh hưởng về thiết bị tăng nếu ánh sáng qua mẫu không đơn sắc hoàn toàn, điều này đã được đề cập phía trên trong phần độ rộng dải tần quang phổ. Quy luật Beer-Lambert dựa trên ánh sáng đơn sắc, nhưng trong thực tế sẽ tạo ra một phổ bước sóng đi qua mẫu và có độ hấp phụ khác nhau tương ứng khi đặt một bước sóng. Kết quả là ảnh hưởng tới lượng ánh sáng đo được và nó sẽ không tỉ lệ với nồng độ, tạo ra sai số âm từ đường đồ thị tại mức ánh sáng nhỏ hơn do nồng độ lớn hơn. Chỉ nhận thấy rõ ràng ảnh hưởng này trong trường hợp các đỉnh hấp thụ hẹp khi so với độ rộng dải quang phổ; nó không phải là vấn đề với chế độ đặt đặc trưng mà đã được trình bày trong phần trước.
<o> </o>
Sai lệch hóa tính tăng khi giá trị cực đại bước sóng thay đổi do điều kiện dung dịch. Một số nucleic acid bị ảnh hưởng khi dung dịch đệm thay đổi pH mà đưa ra sự thay đổi bước sóng lên tới 5nm. DNA từ mạch kép sang mạch đơn làm tăng độ hấp thụ (độ đậm quang học - hyperchromicity) làm thay đổi cường độ hấp thụ tại 260nm. Trong thực tế, nên phá đông mẫu DNA đúng cách, ủ tại nhiệt độ cao (80–90°C) và làm lạnh từ từ trước khi đo.<o></o>
<o> </o>
Khi định lượng nucleic acid và protein tại 280nm tại sao thường làm việc trong dải hấp thụ 0.1-0.8 tại 260 nm?<o></o>
<o> </o>
Hầu hết quang phổ kế tốt sẽ tạo ra đáp ứng tuyến tính (độ hấp thụ và nồng độ) trong khoảng giá trị hấp thụ 0.1-0.8 nên người ta thấy rằng phổ này an toàn khi định lượng mẫu. Nếu bạn làm việc ngoài phổ này, quan trọng là bạn tạo ra đường chuẩn có đủ lượng điểm chuẩn để chứng tỏ mối liên hệ giữa độ hấp thụ và nồng độ là tin cậy và có tính thống kê.<o></o>
Phải thực hiện một nghiên cứu căn chỉnh tương tự như thế với cuvette bạn sử dụng. Thiết kế, chất lượng, và độ dài đường truyền sáng của cuvette có thể ảnh hưởng tới tín hiệu trong thí nghiệm căn chỉnh này. Việc tính toán nồng độ protein và peptide cũng cần đường tuyến tính của đáp ứng và áp dụng những nguyên tắc tương tự trong các phép đo chúng (Calculations of protein and peptide concentration also require linearity of response and the same principles apply to their measurements).<o></o>
Đèn deuterium có thể tạo ra đáp ứng tuyến tính lên tới ba đơn vị của độ hấp thụ đáp ứng tuyến tính này của các đèn xenon giảm gần hai đơn vị hấp thụ (Deuterium lamps can generate linear responses up to three units of absorbance;the linear response of xenon lamps decreases at approximately two units of absorbance.).<o></o>
<o> </o>