Western blot overview
(dịch từ http://en.wikipedia.org/wiki/Western_blot và sẽ tìm hiểu chi tiết sau) <o
></o>
<o> </o>
Western Blot (còn có cách gọi khác là blot miễn dịch) là phương pháp phân tích sử dụng để phát hiện protein trên mẫu mô hay dịch chiết mô (tissue homogenate or extract). Phương pháp này sử dụng điện di để phân tách protein còn nguyên vẹn hay đã biến tính theo độ dài của mạch polypeptide (trong điều kiện biến tính) hoặc bằng cấu trúc ba chiều của protein (khi còn nguyên vẹn hay không biến tính). Sau đó chuyển protein này lên màng (thường sử dụng là nitrocellulose hay PVDF), ở đó chúng được gắn (xác định) bằng kháng thể đặc hiệu với protein đích.<o
></o
>
<o
> </o
>
Có nhiều công ty hóa chất chuyên cung cấp kháng thể (cả loại đơn dòng và đa dòng) tương ứng với hàng ngàn protein khác nhau. Kháng thể thương mại thường có giá thành cao mặc dù có thể tái sử dụng kháng thể không liên kết giữa các lần thí nghiệm. Phương pháp này được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như sinh học phân tử, hóa sinh, hay miễn dịch gen (immunogenetics).<o
></o
>
<o
> </o
>
Những kỹ thuật liên quan khác có sử dụng kháng thể để xác định protein trên mô hay tế bào bằng cách nhuộm miễn dịch (immunostaining) hay ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay-hấp thụ miễn dịch liên kết enzyme).<o
></o
>
<o
> </o
>
Phương pháp này bắt nguồn từ phòng thí nghiệm của George Stark tại Stanford. W. Neal Burnette đặt tên western blot cho kỹ thuật này dựa trên tên Southern blot, một kỹ thuật xác định DNA phát triển bởi Edwin Southern. Northern blot là kỹ thuật xác định RNA.<o
></o
>
<o
> </o
>
Các bước thực hiện trong Western blot<o></o>
<o
> </o
>
Chuẩn bị mô<o
></o
>
<o
> </o
>
Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường tế bào. Trong hầu hết các trường hợp, thường xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học có dụng cụ/máy nghiền (blender) (khi lượng mẫu lớn), hay máy đồng hóa (homogenizer), hoặc siêu âm (sonication). Cũng có thể phá tế bào bằng phương pháp cơ học như trên. Tuy nhiên, lưu ý rằng những mẫu vi khuẩn, virus hay mẫu lấy từ môi trường cũng có thể là nguồn protein xác định được trong western blot, không bắt buộc phải là nghiên cứu về tế bào.<o
></o
>
<o
> </o
>
Có thể sử dụng các loại chất tẩy, muối và đệm để thúc đẩy ly giải tế bào và làm tan protein. Thường bổ sung chất kìm hãm protease và phosphatase để ngăn chặn phân hủy mẫu bằng chính enzyme có trong mẫu. Nên thực hiện chuẩn bị mô tại nhiệt độ thấp để tránh biến tính protein.<o
></o
>
<o
> </o
>
Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao gồm nhiều phương pháp lọc, ly tâm để phân tách thành phần tế bào và loại bào quan khác nhau.<o
></o
>
<o
> </o
>
Điện di<o
></o
>
Điện di để phân tách protein trong mẫu. Sự phân tách này dựa trên điểm đẳng điện (
isoelectric point - pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc phối hợp các yếu tố trên. Đặc điểm của quá trình phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc điểm của bản gel.<o
></o
>
<o
> </o
>
Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ biến nhất là gel polyacrylamide và đệm tải là sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS –PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) giữ polypeptide ở trạng thái biến tính sau khi chúng đã bị xử lý với chất khử mạnh và mất đi cấu trúc bậc 2 bậc 3 (thí dụ, cầu disulfide) và do đó phân tách protein dựa trên khối lượng phân tử. Protein trong mẫu mang điện tích âm SDS và dịch chuyển tới cực dương qua mạng acrylamide bản gel. Protein nhỏ di chuyển nhanh hơn và do đó chúng được phân tách theo khối lượng (thường sử dụng đơn vị kilo <st1:city><st1
lace>Daltons</st1
lace></st1:city>, kDa). Nồng độ acrylamide xác định khả năng phân tách (độ phân giải) của bản gel – nồng độ càng cao thì phân tách càng tốt protein có khối lượng phân tử nhỏ. Protein chỉ di chuyển theo một hướng dọc theo bản gel trong hầu hết các màng lai.<o
></o
>
<o
> </o
>
Mẫu được tải lên giếng. Thường để lại một giếng cho thang (marker hay ladder), là sản phẩm thương mại chứa các protein với khối lượng phân tử xác định, được nhuộm để tạo ra băng màu và nhìn thấy được. Khi điện thế được thiết lập trên gel, protein bắt đầu di chuyển với tốc độ khác nhau. Tốc độ khác nhau này sẽ tạo thành vạch khác nhau trên mỗi giếng.<o
></o
>
<o
> </o
>
Cũng có thể sử dụng gel 2 chiều (
two-dimensional (2-D) gel) để phân tách protein từ một mẫu theo hai chiều. Theo chiều thứ nhất, protein được phân tách theo điểm đẳng điện (pH tại đó protein không mang điện tích) và chiều thứ hai theo khối lượng phân tử của protein.<o
></o
>
<o
> </o
>
Chuyển lên màng lai<o
></o
>
Để kháng thể có thể xác định được thì protein phải được chuyển từ gel lên màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene diflouride (PVDF). Đặt màng lên mặt bản gel rồi đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên. Đặt cả bộ trong dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng lực mao dẫn, và mang theo cả protein. Có thể chuyển protein bằng phương pháp khác gọi là electroblot và sử dụng dòng điện để kéo protein từ gel lên màng PVDF hay nitrocellulose. Protein di chuyển từ gel lên màng và vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả của quá trình lai thấm này là protein được phơi ra trên lớp mỏng để thực hiện xác định (như sẽ trình bày). Cả hai loại màng này bởi đặc tính liên kết protein không đặc hiệu (khả năng liên kết với tất cả protein là tương đương). Liên kết protein dựa trên tương tác khị nước, cũng như tương tác điện tích giữa màng và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng dễ vỡ và không bền nếu tái dò.<o
></o
>
<o
> </o
>
Có thể kiểm tra sự đồng nhất và hiệu quả cuối cùng của quá trình chuyển protein từ gel lên màng bằng cách nhuộm màng với Coomassie hay Ponceau S. Thường sử dụng Ponceau S hơn bởi nó có độ nhạy cao và tính tan trong nước làm cho dễ rửa chất nhuộm và dò màng như sẽ mô tả trong phần sau.<o
></o
>
<o
> </o
>
Phong bế<o
></o
>
Bởi chọn màng do nó có khả năng liên kết với protein, cả kháng thể và protein đích đều là protein nên cần thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể sử dụng để xác định protein đích. Phong bế các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng – điển hình là albumin huyết tương bò (
Bovine serum albumin (BSA)) hay sửa bột không béo (đều có giá thành thấp) với phần nhỏ chất tẩy như Tween 20. Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa bám vào. Do đó, khi bổ sung kháng thể, sẽ không còn chỗ trên màng để nó bám vào ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này giảm “nhiễu” trong sản phẩm cuối của Western blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ dương tính giả.<o
></o
>
<o
> </o
>
Phát hiện<o
></o
>
Trong quá trình phát hiện màng được “dò” protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi mà có khả năng liên kết với enzyme thông báo. Enzyme này tác dụng với cơ chất tương ứng tạo phản ứng màu. Có nhiều nguyên nhân dẫn tới điều này thường diễn ra trong quá trình hai bước mặc dù phương pháp xác định một bước vẫn được áp dụng trong một số trường hợp. <o
></o
>
<o
> </o
>
Hai bước<o
></o
>
Kháng thể sơ cấp<o
></o
>
Tạo kháng thể sơ cấp khi cho vật chủ hay canh trường tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm (hay một phần của nó). Thông thường, đây là phần trong đáp ứng miễn dịch. Kháng thể thu nhận và sử dụng là một công cụ xác định đặc hiệu mà có thể liên kết trực tiếp với protein.<o
></o
>
<o
> </o
>
Sau khi phong bế, ủ dịch loãng kháng thể sơ cấp (thường sử dụng nồng độ 0.5 and 5 micrograms/ml) với màng và có lắc nhẹ. Tiêu biểu là dung dịch này gồm dịch muối đệm với lượng nhỏ chất tẩy và đôi khi có sữa bột hay BSA. Có thể giữ dịch kháng thể và màng và ủ cùng một nơi trong thời gian 30phút tới qua đêm. Cũng có thể ủ ở nhiệt độ khác, nhiệt độ càng cao càng kích thích liên kết, cả liên kết đặc hiệu (protein đích) và không đặc hiệu (nhiễu).<o
></o
>
<o
> </o
>
Kháng thể thứ cấp<o
></o
>
Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, tiếp tục gắn kháng thể thứ hai, bám trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng thể sơ cấp. Kháng thể này được biết tới là kháng thể thứ cấp và do đặc điểm hướng đích, kháng thể thứ cấp có xu hướng được đưa ra dưới dạng "kháng chuột" "kháng thỏ”, v.v. Kháng thể thu từ nguồn động vật (hay canh trường khối tế bào lai động vật); kháng thể kháng chuột sẽ liên kết với bất kỳ kháng thể sơ cấp nào có nguồn gốc từ chuột. Điều này cho phép tiết kiệm chi phí cho toàn phòng thí nghiệm bởi có thể dùng chung một nguồn kháng thể và cho kết quả ổn định theo thời gian. Cũng thường liên kết kháng thể thứ cấp với biotin hay một enzyme như
alkaline phosphatase hay
horseradish peroxidase. Điều này có nghĩa là có nhiều kháng thể sơ cáp sẽ liên kết với kháng thể sơ cấp và khuếch đại tín hiệu.<o
></o
>
<o
> </o
>
Phổ biến nhất là sử dụng kháng thể gắn
horseradish peroxidase trong liên kết với chất huỳnh quang hóa học, và sản phẩm phản ứng phát ra huỳnh quang tỉ lệ với lượng protein. Có thể thu được hình ảnh này trên film ảnh.<o
></o
>
<o
> </o
>
Như với quy trình
ELISPOT và
ELISA, cơ chất phản ứng với enzyme tạo màu nhìn trên màng.<o
></o
>
<o
> </o
>
Phương pháp thứ bai là sử dụng dấu phóng xạ thay vì enzyme đi kèm với kháng thể thứ cấp, như gắn protein liên kết kháng thể như Protein A của Staphylococcus với đồng vị phóng xạ iot. Do các phương pháp khác đều an toàn, nhanh và rẻ hơn nên rất ít sử dụng phương pháp này.<o
></o
>
<o
> </o
>
Một bước<o
></o
>
Quá trình dò được thực hiện theo hai bước bởi tạo ra kháng thể sơ cấp và thứ cấp trong các quá trình riêng biệt là tương đối dễ. Điều này mang lại cho nghiên cứu viên và các tổ chức nhựng ưu điểm như linh động và bổ sung bước khuyếch đại trong quá trình xác định. Tiến bộ của protein hiệu năng cao và những hạn chế giảm đi trong xác định được đưa ra, nhưng người ta vẫn quan tâm tới việc phát triển hệ thống dò một bước mà cho phép việc xác định diễn ra nhanh hơn và ít tốn kém hơn. Điều này cần tới kháng thể dò vừa có khả năng nhận ra protein quan tâm vừa chứa nhãn có thể xác định, đầu dò thường được biết tới dưới dạng gọi là đuôi protein. Ủ đầu dò sơ cấp với màng theo cách tương tự như với kháng thể sơ cấp trong quá trình hai bước, sau đó sẵn sàng để xác định trực tiếp sau khi rửa nhiều lần. <o
></o
>
<o
> </o
>
Phân tích<o
></o
>
Sau khi rửa loại kháng thể không gắn lên màng cũng là lúc màng lai đã sẵn sàng để xác định đầu dò mà đã đánh dấu và liên kết với protein quan tâm. Trong thực tế, không phải tất cả western đều biểu hiện protein chỉ tại một băng trên màng. Khối lượng xác định gần đúng bằng cách so sánh băng nhuộm với thang đo khi điện di. Quá trình này cũng được thực hiện đối với protein cấu trúc, như actin hay tubulin, mà protein dạng này không nên thay đổi giữa các mẫu. Lượng protein đích được chỉ tương ứng với protein cấu trúc để kiểm chứng giữa các nhóm. Thực hành chắc chắn rằng tổng lượng protein trên màng là đúng trong trường hợp có sai sót hay việc chuyển không hoàn thiện.<o
></o
>
<o
> </o
>
Xác định màu<o
></o
>
Phương pháp xác định màu phụ thuộc vào quá trình ủ của western blot với cơ chất phản ứng với enzyme để chỉ thị (như peroxidase) có liên kết với kháng thể thứ cấp. Nó sẽ chuyển chất nhuộm tan thành dạng không tan hiện màu kết tủa ngay tại vị trí enzyme gắn và do đó làm màng hiện màu. Quá trình hiện màu dừng lại bằng cách rửa chất nhuộm tan. Đánh giá biểu hiện protein bằng mật độ kế (
densitometry) (nhuộm đậm tới mức nào) hay quang phổ kế (
spectrophotometry)<o
></o
>
<o
> </o
>
Xác định phát quang hóa học<o
></o
>
Phương pháp xác định bằng phát quang hóa học phụ thuộc và quá trình ủ trong western blot với cơ chất phát quang khi phơi chất chỉ thị gắn trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng phát ra thu được bằng film ảnh, hoặc máy chụp CCD mà có thể bắt được ảnh kĩ thuật số của màng lai. Hình ảnh này phân tích bằng mật độ kế, máy đo lượng tương đối protein nhuộm và định lượng kết quả theo mật độ quang. Phần mềm mới có khả năng phân tích tín hiệu khác như khối lượng phân tử nếu sử dụng đúng loại chất chuẩn.<o
></o
>
<o
> </o
>
Xác định phóng xạ<o
></o
>
Phương pháp đánh dấu phóng xạ không cần cơ chất enzyme, nhưng phải đặt film X quang trực tiếp trước màng lai như phơi nó lên dấu phóng xạ và tạo vùng tối mà tương ứng với băng protein quan tâm. Chi phí cao, ảnh hưởng tới sức khỏe và an toàn của người sử dụng và thường thay thế bằng ECL (Còn có ưu điểm là: The importance of radioactive detection methods is declining?
à Coming soon)<o
></o
>
<o
> </o
>
Xác định huỳnh quang<o
></o
>
Đầu dò đánh dấu huỳnh quang kích thích bằng ánh sáng và xác định ánh sáng phát ra bằng cảm biến quang như máy CCD được trang bị với bộ lọc ánh sáng tương ứng. Máy CCD sẽ thu ảnh kỹ thuật số của màng lai và có thể tiến hành phân tích sâu hơn về khối lượng phân tử hay định lượng trên màng lai. Ảnh huỳnh quang là một trong những phương pháp nhạy nhất để phân tích màng lai.<o
></o
>
<o
> </o
>
Dò thứ cấp<o
></o
>
Khác biệt lớn giữa màng nitrocellulose và PVDF liên quan tới khả năng hỗ trợ việc tách loại kháng thể và tái sử dụng màng cho kháng thể khác. Trong khi có nhiều quy trình tốt thiết lập để tách loại kháng thể trên màng nitrocellulose, PVDF lại dễ thực hiện việc tách loại này hơn và tái sử dụng nhiều hơn trước khi thí nghiệm ảnh hưởng bởi nhiễu trên nền. Một điểm khác nữa là không như nitrocellulose, phải lắc PVDF trong cồn 95%, isopropanol hay methanol trước khi sử dụng. Màng PVDF thường dày hơn và bền hơn trong quá trình sử dụng.<o
></o
>
).
