Dịch cuốn MOLECULAR BIOLOGY PROBLEM SOLVER

[happyfly]

CHUẨN BỊ THÍ NGHIỆM LAI

Thí nghiệm lai thường cần đầu tư đáng kể về thời gian và công sức trước khi thu được kết quả. Phân tích về nhu cầu và đánh giá đúng tình trạng thí nghiệm khi lai sẽ giúp bạn lựa chọn chiến lược hiệu quả và hành động đúng nhất.

Tính kiên trì rất quan trọng
Dữ liệu phép lai thu từ rất nhiều thí nghiệm, mỗi lần lại có những yếu tố khác nhau. Biến đổi của bất kỳ yếu tố nào (nồng độ muối, nhiệt độ, nồng độ chất dò) cũng thường có ảnh hưởng tới các yếu tố khác. Do tương tác khá phức tạp giữa nguyên nhân và ảnh hưởng, phải chú ý rằng từng bước trong quy trình lai là thí nghiệm cần tối ưu hóa. Nhà sản xuất thiết bị và hóa chất lai cũng cung cấp chiến lược để tối ưu cho sản phẩm của họ.

Những yêu cầu quan trọng nhất của bạn là gì?
Hãy xem kĩ yêu cầu của bạn trước khi đi sâu vào lựa chọn phương pháp lai. Tiêu chuẩn nào quan trọng nhất trong nghiên cứu của bạn – tốc độ, chi phí, độ nhạy, tinh (khả năng lặp lại kết quả) hay thô, định tính hay định lượng?

Hình dung quá trình lai của bạn
Xem xét các cấu trúc có thể có của đầu dò đã đánh dấu/dò (labeling) của bạn và so sánh chúng với đích. Nên sẵn sàng thay đổi chiến lược đánh dấu và lai dựa trên thí nghiệm bạn thực hiện.

Bạn biết gì về đích?
Yêu cầu về độ nhạy trong hệ thống được xác định chủ yếu dựa trên hàm lượng đích. Lượng đích gần như đúng với nguyên liệu lúc đầu. Plasmid, cosmid, phagemid như colony lift hay màng lai chấm điểm, và sản phẩm PCR thường có lượng đích trung bình tới cao. DNA hệ gen được coi là nguồn đích thấp tới trung bình. Hầu hết gen prokaryote tồn tại chỉ dưới dạng đơn bản sao (single copy), trong khi hệ gen eukaryote ngoài đơn bản sao còn có nhiều gen có độ lặp lại cao (lượng trung bình) (Anderson, 1999). Tuy nhiên, nên xem xét yêu cầu độ nhạy cho đơn gene đơn bản sao là phụ thuộc vào mẫu bởi một số gene ban đầu được cho là đơn bản sao được phát hiện sau đó là đa bản sao. Lewin (1993) đã nêu ví dụ về cây đa bội mà hệ gen của nó lặp lại một cách hoàn toàn. Trường hợp RNA thì đơn giản hơn; 80% bản sao RNA tồn tại với lượng nhỏ, từ đó làm tăng yêu cầu về độ nhạy trong hầu hết thí nghiệm Northern hay liên quan tới bảo vệ khỏi nuclease (Anderson, 1999).

Nếu bạn không chắc chắn về lượng đích, hãy kiểm tra chuỗi nồng độ đích (van Gijlswijk, Raap, và Tanke, 1992; De Luca và cs., 1995). Nhà sản xuất hệ thống xác định thường cung cấp kết quả họ thực hiện với chuỗi pha loãng đích. Lượng đích đã biết lai với mẫu dò sẽ chỉ ra giới hạn thấp nhất xác định được của một kit hay của phương pháp. Hãy thực hiện đường hướng thí nghiệm tương tự để xác định yêu cầu về độ nhạy và tính hữu dụng của một hệ thống. Chiến lượng này đòi hỏi phải biết chính xác tổng lượng đích chấm trên màng.

Bạn biết gì về mẫu dò và khuôn dò?
Bạn càng biết rõ thông tin về trình tự và cấu trúc về mẫu dò và đích, bạn càng dễ đạt được kết quả mong muốn trong quá trình lai (Bloom và cs., 1993). Thí dụ, kích thước và thành phần của vật liệu bạn sử dụng để tạo mẫu dò sẽ ảnh hưởng tới việc bạn chọn chiến lược đánh dấu và điều kiện lai, sẽ được thảo luận trong Chiến lược đánh dấu nào là phù hợp nhất trong trường hợp của bạn? Nên chú ý thành phần GC, cấu trúc bậc 2, và độ tương đồng với đích; những phần chi tiết hơn vượt quá nội dung của chương này (Xem Anderson, 1999; Shabarova, 1994; Darby, 1999; Niemeyer, Ceyhan, và Blohm, 1999; và
http://www2.cbm.uam.es/jlcastrillo/lab/protocols/hybridn.htm để biết thêm chi tiết)

Có phải hệ thống xác định có độ nhạy cao hơn luôn tốt hơn không?
Độ nhạy cao hơn có thể giải quyết vấn đề nhưng cũng có thể làm phát sinh vấn đề. Hệ thống có độ nhạy càng cao càng khó bỏ qua ảnh hưởng nền.
Mẫu dò phát ra tín hiệu cực mạnh chỉ cần phơi lên phim trong thời gian rất ngắn, do đó gây khó khăn để thu nhận toàn bộ tín hiệu hay theo cách bạn có thể điều khiển được.

Độ nhạy femtogram (10-15 gram) sử dụng để xác định gen bản sao đơn và đặc trưng cho giới hạn xác định thấp hơn cho mẫu dò nhạy nhất. Phương pháp tại hoặc dưới độ nhạy Femtogram có thể xác định từ 1 tới 5 phân tử, nhưng làm tăng sự khó khăn để nhận rõ tín hiệu dương tính khi sàng lọc đích có lượng bản sao thấp (Klann và cs., 1993; Rihn và cs.,1995). Kĩ thuật như cộng hưởng từ hạt nhân hoặc phổ khối lượng sẽ xác định đơn phân tử tốt hơn.

Việc chạy theo mẫu dò mới để đạt độ nhạy cao hơn có thể sinh ra chi phí không cần thiết. Tới 56% vị trí có mặt trong mạch 486 nucleotid có thể đánh dấu với dUTP bionylate hóa, nhưng chỉ cần 8% để đạt được cấp liên kết tương tự như Streptavidin hơn là những mẫu dò đánh dấu có độ nhạy cao hơn (Up to 56% of all available sites in a 486 nucleotide (nt) transcript could be labeled with biotinylated dUTP, but 8% was sufficient to achieve similar binding levels of Streptavidin than higher-density labeled probes) (Fenn và Herman, 1990). Thay một hay nhiều bước trong quy trình lai để khắc phục vài trong số các vấn đề đã đề cập phía trên. Điều quan trọng là hãy đánh giá nhu cầu thực tế, lợi ích và chi phí khi tăng độ nhạy.

Bạn có thể thu được gì từ dữ hiệu độ nhạy thương mại?
Nhà sản xuất có thể mô tả chính xác độ nhạy tương đối hệ thống đánh dấu của riêng họ. Việc so sánh giữa các hệ thống đánh dấu cung cấp bởi nhà sản xuất khác nhau ít đáng tin cậy bởi họ sử dụng điều kiện tối ưu riêng. Bạn có nên hi vọng tạo ra được độ nhạy thương mại đã công bố hay không? Câu trả lời là có, một cách tương đối và bạn phải tối ưu chiến lược của mình. Tuy nhiên, với rất nhiều bước trong một thí nghiệm lai (điện di, lai, đánh dấu, và xác định), việc so sánh định lượng giữa hai hệ thống khác nhau không bao giờ là toàn vẹn. Đường hướng tốt để đánh giá là kiểm tra tương ứng từng khía cạnh giữa các hệ thống xác định mà tận dụng kiểm chứng dương tính tương ứng hay hệ thống mẫu dò/đích đơn giản để định lượng chính xác (thí dụ: chuỗi pha loãng của một gen chuẩn – housekeeping gene). (Side-by-side testing of different detection systems utilizing the respective positive controls or a simple probe/target system of defined quantities (e.g., a dilution series of a housekeeping gene) is a good approach to evaluation.)

VẤN ĐỀ TRONG ĐÁNH DẤU
Chiến lược đánh dấu nào phù hợp nhất trong trường hợp của bạn?
Mỗi chiến lược đánh dấu đều cung cấp đặc điểm, lợi ích, giới hạn và tiêu chuẩn quan trọng cần chú ý để lựa chọn mẫu dò phù hợp nhất với trường hợp của bạn (Anderson, 1999; Nath và Johnson, 1998; Temsamani và Agrawal, 1996; Trayhurn, 1996;Mansfield và cs., 1995;Tijssen, 2000). Những câu hỏi đưa ra trong phần kế tiếp sẽ chứng minh tại sao chỉ thí nghiệm thực tế, có đánh giá khi sử dụng kiểm chứng dương tính và âm tính, mới có thể lựa chọn đúng nhất.
Sau đây đưa ra thí dụ để thảo luận tính phức tạp khi lựa chọn chiến lượng đánh dấu phù hợp. Giả định rằng để sàng lọc một đích bạn phải chọn một trong những khuôn sau: oligo 30 base (30mer), mảnh xoắn kép DNA 800bp, hoặc mảnh xoắn kép 2 kb.

 

[happyfly]

30-mer
Mảnh 30-mer có thể đánh dấu phóng xạ đầu 5’ nhờ T4 polynucleotide kinase (PNK) hoặc đầu 3’ nhờ Terminal
deoxynucleotidyl transferase (TdT). PNK gắn một phân tử của nhóm phosphate phóng xạ trong khi phản ứng TdT thường thiết kế để gắn thêm dưới 10 nucleotide. PNK không tạo ra đầu dò ổn nhất do chỉ đánh dấu một phân tử phóng xạ, nhưng việc thay thế P32 vào cấu trúc phospho chưa đánh dấu sẽ không biến đổi cấu trúc hay sự đặc hiệu của mẫu dò. TdT có thể tạo ra đầu dò đánh dấu phóng xạ nhiều hơn. Nó tăng tín hiệu nhưng có thể làm thay đổi tính đặc hiệu do bổ sung nhiều nucleotide. Có thể tạo ra mảnh 30mer chứa không đánh dấu nhiều phóng xạ bằng máy tổng hợp DNA, nhưng sự có mặt của quá nhiều base đã bị thay đổi có thể biến đổi tính chất lai của mẫu dò (Kolocheva và cs.,1996).

Mảnh 800bp
Cũng có thể đánh dấu mảnh xoắn kép 800bp nhưng hiệu quả phụ thuộc vào sự có mặt của đầu bằng hay đầu dính. Do các mạch bổ sung của mảnh 800bp có thể bắt cặp lại sau khi đánh dấu nên lượng mẫu dò liên kết với đích sẽ giảm. Khuôn không đánh dấu sẽ cạnh tranh với mẫu dò đánh dấu để liên kết với đích làm giảm tín hiệu ra. Tuy nhiên, tổng hợp mẫu dò từ khuôn liên kết cộng hóa trị với giá thể rắn có thể khắc phục được hạn chế này (Andreadis và Chrisey, 2000) (However,probe synthesis from templates covalently attached to solid supports might overcome this drawback).

Đoạn mồi hexamer (random hexamer) hay nanomer ngẫu nhiên và mảnh 800bp có đánh dấu phóng xạ rải rác sẽ tạo ra mẫu dò ưa chuộng hơn mẫu dò đánh dấu ở đầu hay cuối đoạn. Tuy nhiên, chúng không đồng nhất về kích thước và độ đặc hiệu do khởi tạo từ vị trí ngẫu nhiên trên khuôn. Mẫu dò có thể từ khoảng 20 nucleotide đến cả đoạn khuôn và hay dài hơn (Moran và cs., 1996; Islas, Fairley, và Morgan, 1998). Tuy nhiên, kích thước mẫu dò trong hầu hết phản ứng có đánh dấu bằng mồi ngẫu nhiên nằm trong khoảng 200-500nt.

Nếu toàn bộ mảnh 800bp bổ sung với đích thì tập hợp mẫu dò gồm nhiều loại khác nhau sẽ không gây hại. Khuôn chỉ chứa một nửa trình tự bổ sung với đích có thể giảm độ nhạy. Bất kì cố gắng nào để bù độ nhạy đã mất như tăng nồng độ mẫu dò có thể tạo nhiều nền hơn. Tuy nhiên, nên quan tâm tới tính chính xác của phép lai. Có thể thay đổi điều kiện rửa để phục hồi tính chính xác đã thu được với trình tự mẫu dò bổ sung hoàn thiện với đích.

Mảnh DNA 2kb
Sự bất hợp tác của đánh dấu phóng xạ vào mẫu dò phát sinh do việc đánh dấu đoạn mồi ngẫu nhiên không biến đổi nghiêm trọng giữa những khuôn từ 300 tới 2kb, mặc dù kích thước trung bình của mẫu dò được sinh ra từ những khuôn lớn hơn là lớn hơn (Ambion, Inc., dữ liệu chưa được công bố). Sự tạo ra một mẫu dò từ một khuôn lớn có thể là thuận lợi (ưu điểm) nếu nó chứa trình tự đích không thể có trong một khuôn nhỏ.

Sự đáp ứng của nhiều loại đánh dấu phóng xạ hay phi phóng xạ có thể làm phức tạp hóa trường hợp của bạn. Hãy hình dung thí nghiệm lai trước khi bạn tiến hành. Xem xét những cấu trúc mẫu dò có thể thực hiện được và so sánh với đích. Hãy sẵn sàng để thay đổi chiến lược đánh dấu và lai dựa trên thí nghiệm đã thực hiện.

Yết tố nào quan trọng khi chọn lựa chất đánh dấu?
Hướng để chọn chất đánh dấu là so sánh cường độ, thời gian đáp ứng và độ phân giải của tín hiệu. Cũng nên xét tới ảnh hưởng của chất đánh dấu khi gắn với mẫu dò và tác động của chất đánh dấu đã gắn với mẫu dò tới quá trình lai của mẫu dò với đích. Lượng chất đánh dấu gắn với mẫu dò cũng có thể ảnh hưởng tới hoạt động của chất đánh dấu và khả năng mẫu dò liên kết với đích. Những nhà nghiên cứu có kinh nghiệm sẽ sử dụng ít nhất phương pháp để xác định chiến lược tốt nhất khi tạo mẫu dò mới (nếu khả năng cho phép).

Cường độ và độ phân giải tín hiệu
Cường độ tín hiệu chất đánh dấu phóng xạ hay phi phóng xạ tỉ lệ nghịch với độ phân giải tín hiệu.
Chất phóng xạ
Cường độ tín hiệu của chất đồng vị giảm theo trình tự: P32>P33>S35>H3. Khi cần quan tâm nhất tới độ nhạy, như trong trường hợp nghiên cứu gen có lượng bản sao nhỏ, thường chọn P32. Tritium thường quá yếu trong hầu hết các ứng dụng lai, nhưng mẫu dò nucleic acid đánh dấu với rất nhiều nucleotide tritium hóa có thể tạo ra tín hiệu có độ phân giải cao và hữu ích mà không phải lo về phân hủy phóng xạ của mẫu dò. Thường sử dụng H3 và S35 trong các ứng dụng như lai in situ(ISH) mà trong đó coi trọng độ phân giải hơn độ nhạy. Độ phân giải của P33 tương tự như S35, nhưng Ausubel và cs..(1993) đã chỉ ra P33 có thể tăng tỉ lệ tín hiệu/nhiễu khi ứng dụng trong ISH.

Chất phi phóng xạ
Khó so sánh cường độ tín hiệu của chất đánh dấu phi phóng xạ. Thực tế thường sử dụng độ nhạy thay cho cường độ tín hiệu. Khi định lượng, độ phân giải của tín hiệu phi phóng xạ cũng phức tạp hơn bởi độ phân giải là cường độ tín hiệu tại thời điểm xác định và hầu hết tín hiệu phi phóng xạ yếu đi nhiều theo thời gian. Vì vậy, phải xét khoảng thời gian phơi trên film trong bất kỳ trường hợp cần tới độ phân giải nào. Cũng phải xem xét nền phát quang hay huỳnh quang từ màng lai. Chất nhuộm gần vùng tia gần khoảng hồng ngoại rất phù hợp do biểu hiện tự nhiên của ánh sáng vùng này thấp (Middendorf, 1992) Near-infrared dyes are superior due to low natural near-infrared occurrence. Có một số chất nhuộm phát gần vùng ánh sáng đỏ = 700nm (Cy7, Alexa Fluor 549, allophycocyanin).

Phương pháp đánh dấu phi phóng xạ, hiện màu trước kia gặp vấn đề về độ phân giải bởi chất đánh dấu khuếch tán trong màng. Các hóa chất mới, đặc biệt một số chất hóa học huỳnh quang kết tủa có thể giảm hiện tượng này. Bổ sung chất nhớt như glycerol để giảm ảnh hưởng khuếch tán. Chất màu và một số chất phát quang hóa học sẽ phá hủy độ phân giải nếu quá trình phản ứng vượt quá thời gian đề nghị hay khi tín hiệu quá mạnh. Sau đó, nền có thể tăng đột ngột do khuyếch tán cơ chất.

Tốc độ xác định
Mohandas Ghandi đã nói “Cuộc sống không chỉ là tăng tốc độ - there is more to life than increasing its speed” (John-Roger và McWilliams, 1994). Điều này vẫn đúng trong hệ thống xác định. Hầu hết hệ thống xác định đều phát tín hiệu trong nhiều phút hoặc nhiều giờ, nhưng là vô ích nếu không thể xác định đích có lượng bản sao thấp. Nghiên cứu gen đơn bản sao với mẫu dò đánh dấu P32 có thể đòi hỏi biểu hiện trong rất nhiều tuần, nhưng ít nhất đích cuối cùng cũng được nhận ra.

Khoảng thời gian tồn tại tín hiệu
Bạn có cần xác định tín hiệu từ màng lai nhiều lần sau nhiều giờ hay ngày không? Đích của bạn có lượng bản sao thấp cần thời gian biểu hiện tính bằng ngày hay tuần không? Bạn có cần tín hiệu ngắn để tránh việc tháo khuôn trước khi tái dò không?

Một số hệ thống xác định phi phóng xạ cho phép bất hoạt nhanh chóng enzyme phát tín hiệu, do đó không cần tháo khuôn trước khi tái dò (Peterhaensel, Obermaier, và Rueger, 1998). Sẽ thảo luận chi tiết hơn về những ảnh hưởng và tiềm ẩn của việc tháo khuôn trong chương sau.

Thời gian tồn tại hiệu quả của chất đánh dấu phóng xạ thông thường là một vài ngày hay tuần. Điều này phụ thuộc vào chất đánh dấu, phối tử và môi trường như đã thảo luận trong Chương 6, “Làm việc an toàn với các vật liệu phóng xạ.” Một số hệ thống phi phóng xạ dựa trên phosphatase kiềm phát tín hiệu bền trong 10 ngày mà không có sự giảm đi đáng kể của tín hiệu (theo quan sát cá nhân). Một số hệ thống phát quang hóa học tạo chất kết tủa phát sáng có khả năng tạo ra tín hiệu tích tụ được. Điều này gần giống chất đồng vị.

Thời gian tồn tại chức năng của chất đánh dấu huỳnh quang sẽ biến đổi tùy theo tính chất hóa học của gốc huỳnh quang và phương pháp sử dụng. Thí dụ, có thể xác định thời gian tồn tại của gốc huỳnh quang bằng số lần chất phát màu bị kích thích và phát quang. Một số gốc có thể chỉ kích thích/quét được trong một hay rất ít lần, trong khi số khác lại ổn định hơn trong nhiều lần. Tham khảo nhà sản xuất chất đánh dấu để có thông tin về tính ổn định cho chất bạn sử dụng. Trong hệ thống có enzyme hoạt hóa để tạo ra chất phản ứng cần cho phát huỳnh quang, chu kì bán rã của enzyme và nồng độ cơ chất có thể quyết định thời gian tồn tại tín hiệu.

Chất đánh dấu có kết hợp hiệu quả với mẫu dò không?
Ảnh hưởng của kích thước, vị trí chất đánh dấu, và phương pháp liên kết dựa trên sự kết hợp của các nucleotide với DNA và RNA phụ thuộc vào enzyme và khó dự đoán. Mạch bên nhỏ có thể kìm hãm sự tổng hợp nucleic acid (Racine, Zhu, và Mamet-Bratley, 1993), trong khi những nhóm có kích thước lớn hơn như biotin có thể không tác động hay rất ít (Duplaa et al., 1993; Richard et al., 1994). Nhìn chung, nucleotide đánh dấu chất đồng vị của những nguyên tử hay có mặt trong nucleotide (P32, P33, H3, C14) sẽ tạo liên kết dưới tác dụng của polymerase DNA và RNA hiệu quả hơn là nucleotide đánh dấu chất đồng vị của nguyên tử không chính thống khác. Polymerase thương mại thường thiết kế để khắc phục được vấn đề về liên kết như vậy.

Một số ứng dụng khai thác liên kết suy yếu của nucleotide đã đánh dấu (Alexandrova et al., 1991). Chất huỳnh quang gắn vào vị trí 5 trên cytosine trong dCTP kìm hãm trasnferase tại điểm cuối và gây ra việc bổ sung một tới hai dNTP đã đánh dấu vào đầu 3’ của DNA. Huỳnh quang- hoặc biotin-riboUTP ứng dụng tương tự nhau (Igloi and Schiefermayr, 1993).

Nếu không có dữ liệu cụ thể liên quan tới hiệu quả kết hợp nucleotide đánh dấu - sự phối hợp của enzyme đánh dấu, hãy liên hệ với nhà sản xuất của cả hai sản phẩm đó. Họ cung cấp điểm khởi đầu đẻ từ đó bạn tối ưu hóa phản ứng đánh dấu của mình.

Chất đánh dấu có ảnh hưởng tới khả năng mẫu dò liên kết với đích không?
Hiệu quả lai có thể biến đổi do cấu trúc hóa học của chất đánh dấu, vị trí chất đánh dấu trong mẫu dò, liên kết của chất đánh dấu với phối tử, và lượng chất đánh dấu trong mẫu dò. Đồng vị của nguyên tố có mặt trong nucleic acid in vivo có thể không biến đổi trực tiếp cấu trúc của mẫu dò. Nhưng như được mô tả dưới đây (và trong Chương 6), chất đánh dấu khi phát xạ có thể làm đứt mẫu dò. Người ta chứng minh tầm quan trọng của vị trí chất đánh dấu bằng cách so sánh hiệu quả lai của mẫu dò đánh dấu với Cy5TM, tạo thành từ C5 hoặc amine bậc 1 gắn vào C4 của dCTP. Việc lai được thực hiện hiệu quả bằng mẫu dò đánh dấu bởi chất đánh dấu liên kết C5 trên cả trình tự. Người ta thường áp dụng mẫu dò này trong ứng dụng microarray (Lee et al., 2000). Mẫu dò chứa chất đánh dấu liên kết với nhóm amin ở C4 lai hiệu quả. Chất đánh dấu amin C4 dùng để bổ sung đơn phân tử Cy5 dCTP vào đầu 3’ của đoạn mồi đã giải trình tự (Ansorge et al., 1992). Người ta đã đưa ra mẫu phân tử để dự đoán chính xác ảnh hưởng của chất đánh dấu lên cấu tạo, liên kết hydro, tương tác có tính tương tự, và cấu trúc khi lai (Yuriev, Scott, and Hanna, 1999).

 

[happyfly]

Vị trí C5 thường được chọn cho dUTP (Petrie, 1991; Oshevskii, Kumarev, và Grachev, 1989). C5 là vị trí đánh dấu hấp dẫn bởi không kết cặp base bằng liên kết hydro. Ngoài ra, một số liên kết dường như cho phép vị trí chất đánh dấu gắn vào vị trí 5, do đó cấu trúc xoắn tạo thành không bị hư hại. Nhưng mảnh đánh dấu có kích thước lớn liên kết với pyrimidine trên vị trí C5 vẫn ảnh hưởng tới quá trình lai ở mức nào đó do án ngữ không gian. Người ta cũng sử dụng vị trí khác trên purine và pyrimidine để gắn chất đánh dấu. Tuy nhiên, chúng cũng chỉ có vai trò như mồi mà không phải cho chiến lược đánh dấu bên trong (Srivastava, Raza, và Misra, 1994).

Độ dài và trình tự liên kết cũng có ảnh hưởng rất lớn. Mảnh rất ngắn ( 4-10 nguyên tử ) khó liên kết và ảnh hưởng tới việc lai (Haralambidis, Chai, và Tregear, 1987). Ngược lại nếu vượt quá độ dài nhất định (>20 phân tử), sự liên kết và lai bị giảm. Người ta đã sử dụng mẫu về án ngữ không gian để giải thích cho hiện tượng này (Zhu, Chao, và Waggoner, 1994).

Đánh dấu quá mức
Ngoại trừ rất ít trường hợp, không nên đánh dấu nội tại hoàn toàn 100% mẫu dò phóng xạ và phi phóng xạ. Chất phát xạ beta mạnh (P32, P33) sẽ phân hủy mẫu dò đã đánh dấu. Đoạn mồi ngẫu nhiên-mẫu dò đánh dấu với P-dCTP tới hoạt độ đặc hiệu 10cpm/mg sẽ có kích thước trung bình 300 tới 500 nucleotide ngay sau khi đánh dấu. Sau khi bảo quản ở 4°C trong 24 giờ, đoạn đó sẽ giảm đi còn 100 nucleotide hay ngắn hơn (Amersham Pharmacia Biotech, theo quan sát chưa được công bố). Pha loãng tối đa mẫu dò ngay sau khi đánh dấu để giảm sự phân giải do phóng xạ này.

Mật độ cao của chất đánh dấu phi phóng xạ có kích thước lớn có thể ảnh hưởng tới việc kết cặp và duỗi ra của mạch bởi án ngữ không gian (Zhu và Waggoner, 1997; Lee và cs., 1992; Day và cs., 1990; Mineno và cs., 1993). Người ta thiết kế mạch liên kết gắn chất đánh dấu với nucleotide chỉ có thể giảm thiểu ảnh hưởng này (Petrie và cs., 1991) chứ không thể loại trừ nó một cách hoàn toàn.

Mật độ chất đánh dấu cao cũng có thể gây ra việc xóa hoàn toàn. Người ta đã mô tả tác động xóa khi mật độ chất huỳnh quang lớn hơn 1 trong 10 (??? Quenching effects for fluorescein densities greater than 1 in 10 have been described) (Makrigiorgos, Chakrabarti, và Mahmood, 1998). Nhà sản xuất kit đánh dấu phi phóng xạ đã tối ưu protocol để tránh ảnh hưởng từ chất đánh dấu. Hãy tham khảo nhà sản xuất trước khi bạn định thay đổi quy trình đã đề nghị.

 

[happyfly]

SO SÁNH CÁC CHIẾN LƯỢC ĐÁNH DẤU PHÓNG XẠ VÀ PHI PHÓNG XẠ
Quyết định áp dụng phương pháp đánh dấu phóng xạ hay phi phóng xạ và hệ thống xác định là dựa trên độ nhạy, tính định lượng, chi phí, sự an toàn và đơn giản khi sử dụng mà trong chương này sẽ nêu ra một số tiêu chuẩn. Cho dù bạn có thể đánh giá nhu cầu nghiên cứu của mình trên giấy theo những tiêu chuẩn trên, quyết định cuối cùng vẫn phải dựa trên thí nghiệm thực tế. Thay vì cần kiểm tra riêng từng hệ thống, nhiều nghiên cứu đã so sánh độ nhạy của các mẫu dò phi phóng xạ với tiêu chuẩn vàng P32: Yang và cs.(1999), Plath, Peters, và Einspanier (1996), Nass và Dickson (1995), Moore và Margolin (1993), Puchhammer-Stoeckl, Heinz, và Kunz (1993), Engler-Blum và cs. (1993), Bright và cs. (1992), Kanematsu và cs. (1991), Lion và Haas (1990), Jiang, Estes, và Metcalf (1987), Tenberge và cs. (1998), Holtke và cs. (1992), Pollard-Knight và cs.(1990),Hill và Crampton (1994), Dubitsky, Brown, và Brandwein (1992),và Nakagami và cs.(1991).

Yếu tố nào là quan trọng khi xem xét chiến lược đánh dấu phi phóng xạ trực tiếp hay gián tiếp?
Chiến lược đánh dấu trực tiếp sử dụng mẫu dò gắn trực tiếp với chất nhuộm hoặc enzyme, là chất phát tín hiệu xác định. Hệ thống đánh dấu gián tiếp sử dụng mẫu dò chứa hapten. Hapten sẽ liên kết với chất phản ứng thứ cấp để phát tín hiệu xác định; mẫu dò không tự phát tín hiệu. Chất phản ứng thứ cấp điển hình là kháng thể cộng hợp chất nhuộm hoặc enzyme, và phức avidin cộng hợp enzyme.

Độ nhạy
Khó để so sánh độ nhạy của chiến lược đánh dấu trực tiếp và gián tiếp. Chất đánh dấu hoặc nhuộm huỳnh quang gắn trực tiếp vào mẫu dò thường cho độ nhạy thấp hơn. Giới hạn xác định phụ thuộc vào chất đánh dấu hay hiệu quả liên kết với chất đánh dấu, độ khuếch đại chất phản ứng thứ cấp và độ khuếch đại cơ chất hay chất nhuộm. Thí dụ, tăng thời gian phản ứng đánh dấu khi đánh dấu trực tiếp tạo ra mẫu dò nhạy hơn khi đánh dấu gián tiếp, mà đã tạo ra nhiều mẫu dò nhạy hơn trong những thí nghiệm trước (Herzer, P., theo quan sát chưa được công bố).

Việc so sánh khá phức tạp bởi phương pháp đánh dấu trực tiếp và gián tiếp hay chiến lược xác định đòi hỏi khác nhau khi lai, rửa, và xác định. Ngoài ra, những chiến lược khác nhau này hoạt động tùy theo kích thước và cấu trúc của mẫu dò hay khuôn mà mẫu dò được tổng hợp. Bất kỳ dự đoán nào về việc thực hiện các chiến lược này đều không đơn giản.

Nhà sản xuất chất đánh dấu và hệ thống xác định thường so sánh độ nhạy của các sản phẩm khác nhau của họ một cách định tính và có khi cả định lượng.

 

[happyfly]

Tính linh động
Có thể xác định mẫu dò đánh dấu trực tiếp sau khi lai và rửa mà không cần phong bế hay xử lý kháng thể. Kĩ thuật phi phóng xạ trực tiếp hạn chế lựa chọn của bạn đối với lai, dung dịch đệm rửa và việc xác định. Ngoài ra còn gây khó khăn khi tối ưu tỉ lệ tín hiệu/nhiễu. Hệ thống xác định phi phóng xạ gián tiếp thường phù hợp với phương pháp lai và dung dịch đệm rửa thông thường, tuy nhiên lại khó tối ưu khi ủ kháng thể và các bước xác định tiếp theo.

Thế nào là tính ổn định khi bảo quản mẫu dò đã đánh dấu?
Phóng xạ
Trong chương 6 đã trình bày ảnh hưởng của việc phát phóng xạ thấp hay cao từ chất đánh dấu phóng xạ và những phương pháp để giảm tối đa ảnh hưởng của chúng. Lý tưởng là chuẩn bị mới mẫu dò đánh dấu bằng P32, P33, S35 cho mỗi lần thí nghiệm. Nếu bạn muốn bảo quản mẫu dò đánh dấu phóng xạ, nên loại bỏ chất đánh dấu không tương hợp (unincorporated label) trước khi bảo quản. Có thể giảm tối đa sự phá hủy do phát xạ phóng xạ bằng cách pha loãng hoặc bổ sung chất hấp thu phóng xạ như ethanol hay chất khử. Nhưng sau đó cần phải tinh sạch mẫu dò trước khi tái sử dụng. Như trình bày trong Chương 6, việc làm lạnh nhanh mẫu dò đã đánh dấu rất quan trọng để tránh rắc rối do kết tụ gây ra.

Phi phóng xạ
Tính chất hóa học của chất đánh dấu sẽ quyết định điều kiện bảo quản riêng, nhưng nhìn chung, nên chia mẫu dò đánh dấu phi phóng xạ thành phần nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh không sương -20 hoặc -70°C và tránh ánh sáng. Cần tránh quá trình làm đông - tan nhiều lần. Tính ổn định này thay đổi phụ thuộc vào công thức đệm bảo quản và đặc điểm chất đánh dấu (chất đánh dấu huỳnh quang hay enzyme). Nó có thể ổn định từ một tháng tới một năm.

Người ta cho rằng nucleic acid đánh dấu bởi enzyme sẽ khá ổn định nếu được bảo quản trong 50% glycerol tại -20°C trong nhiều tháng, nhưng điều này không phải lúc nào cũng đúng. Do khó khăn khi định lượng hoạt độ lượng enzyme còn lại sau khi bảo quản nên nên chuẩn bị mẫu dò mới để chắc chắn có thể so sánh các kết quả sau nhiều lần thí nghiệm. Đối với mẫu dò đánh dấu bằng chất phát màu hoặc huỳnh quang, phải liên hệ với nhà sản xuất để có được thông tin cập nhật nhất về cách bảo quản. Trong hệ thống xác định dựa trên kháng thể đánh dấu enzyme, điều kiện bảo quản phải duy trì được tình trạng nguyên vẹn của kháng thể, enzyme và mẫu dò.

Nếu bạn định áp dụng bất cứ mẫu dò (phóng xạ hay phi phóng xạ) trong thời gian dài, rất nên sử dụng kiểm chứng dương tính để đánh giá hiệu quả của mẫu dò. Tính ổn định của mẫu dò cũng đóng vai trò trong độ nhạy yêu cầu. Nếu mẫu dò đánh dấu đã được chuẩn bị từ trước vẫn có thể phát sinh ra tín hiệu mong muốn, có thể khẳng định rằng mẫu dò đạt yêu cầu về tính ổn định.

 

[happyfly]

Có nên tái sử dụng mẫu dò của thí nghiệm trước đó cho thí nghiệm mới?
Lượng mẫu dò có đủ?
Hầu hết các ứng dụng cần và dùng mẫu dò dư so với đích. Phụ thuộc vào lượng mẫu dò liên kết với màng lai và ảnh hưởng của quá trình phân hủy, lượng mẫu dò còn lại trong dung dịch lai có thể đủ dùng cho thí nghiệm mới. Có thể sử dụng blot điểm với chuỗi pha loãng DNA đích để xác định mẫu dò có còn đủ dùng hay không.

Hiệu lực đánh dấu
Các vấn đề về thời gian tồn tại và tính ổn định trong bảo quản của chất đánh dấu đã được đề cập phía trên. I (S.H.) đã thành công trong việc tái sử dụng mẫu dò đánh dấu đoạn mồi ngẫu nhiên P32 5 ngày sau thí nghiệm lai đầu tiên. Bảo quản mẫu dò đánh dấu phóng xạ tại -20°C trong đệm lai trong một vài ngày hoặc qua đêm tại 4°C thường không gây ra vấn đề. Không nên tái sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ cho ứng dụng đòi hỏi độ nhạy cao và tính định lượng. Cũng nên xét tới những vấn đề trong bảo quản về chất đánh dấu phóng xạ và phi phóng xạ đã nêu ra trong phần trên.

Việc tái tinh sạch một số mẫu dò từ đệm để bảo quản có thể hữu ích. Mẫu dò peptide nucleic acid (PNA) là một trường hợp mà chi phí cho việc tái tinh sạch nhỏ hơn so với chi phí mẫu dò (Peptide nucleic acids (PNA) probes are an example where the probe expense may justify the expense of re-purification.).

Mẫu dò có thể bị biến tính khi tái sử dụng như thế nào?
Bảo quản mẫu dò trong đệm lai trước khi tái sử dụng. Dung dịch đệm này có thể chứa thành phần làm biến tính mẫu dò (ví dụ, formamide) nên không được đun sôi. Nên chỉ gia nhiệt tới trên Tm bởi tại Tm một nửa lượng nucleic acid đã bị biến tính. Đun sôi có thể cũng phá hủy thành phần đệm như chất phong bế, SDS, volume excluder (Volume Excluders: For restriction enzymes, buffer components such as glycerol and polyethylene glycol that reduce the amount of water at the enzyme-DNA interface. Volume excluders often cause increased star activity, Promega.), và chất đánh dấu. Lý tưởng là gia nhiệt đệm lai chứa mẫu dò 10 - 20°C trên nhiệt độ lai, nhưng cũng phải dưới 20 tới 30°C dưới nhiệt độ sôi.

Xác định hiệu quả kết hợp của tất cả các phản ứng đánh dấu có quan trọng không?
Phản ứng đánh dấu không hề phức tạp. Hiện nay với kit đánh dấu thương mại, thí nghiệm hầu như không bao giờ thất bại. Do đó chúng ta không xác định hiệu quả kết hợp của tất cả mẫu dò đã đánh dấu. Chúng ta chỉ bắt đầu nghi vấn về hiệu quả đánh dấu khi không thỏa mãn với kết quả lai, lúc mà có thể đã muộn để xác định hiệu quả kết hợp.

Hãy xem xét trước khi bỏ qua bất kỳ bước kiểm chứng nào. Tối thiểu là phải xác định hiệu quả kết hợp khi thực hiện kĩ thuật mới, mẫu dò mới, protocol mới, hay kit mới. Cần tinh sạch hay ít nhất là kết tủa Trichloroacetic acid (TCA) mẫu dò đánh dấu phóng xạ để xác định hiệu quả đánh dấu, như được trình bày trong Chương 7, “Tinh sạch DNA”. Việc xác định hiệu quả của phản ứng đánh dấu phi phóng xạ có thể mất nhiều thời gian hơn, thường liên quan tới blot điểm và/hoặc quét điểm dò. Hãy theo những đề nghị của nhà sản xuất để xác định hiệu quả đánh dấu của mẫu dò phi phóng xạ.

Có phải tinh sạch tất cả mẫu dò?
Nucleotide, enzyme, chất liên kết chéo (crosslinking reagents), thành phần đệm và chất tương tự không kết hợp có thể gây nhiễu hoặc ảnh hưởng tới các thí nghiệm tiếp theo. Không cần thu sạch mẫu dò trong thí nghiệm lai mà trong đó thể tích phản ứng đánh dấu mẫu dò không đáng kể so với thể tích đệm lai. Nếu bạn vẫn muốn giảm thiểu những nguy cơ trên, hãy lọc mẫu dò ra khỏi thành phần phản ứng. Tuy có nhiều phương pháp đánh dấu (như mẫu dò sinh ra bởi đánh dấu đoạn mồi ngẫu nhiên với P-dCTP) mà mẫu dò chưa được tinh sạch tạo nền không đáng kể (Amersham Pharmacia Biotech, theo những quan sát chưa công bố), nhưng kết quả lý tưởng này không đúng cho tất cả các mẫu dò. Khi khó giải quyết vấn đề về nền, nhà nghiên cứu phải xem lại việc chuẩn bị mẫu dò. Như đã được thừa nhận, sẽ không sử dụng đường hướng này nếu thí nghiệm gây ra vấn đề nền mà cần tới 5 ngày phơi mẫu để thu kết quả (Lựa chọn khi tinh sạch được trình bày trong Chương 7, “Tinh sạch DNA”.)

 

[happyfly]

MÀNG LAI VÀ HỖ TRỢ
Yếu tố nào quan trọng khi lựa chọn phương pháp trợ giúp cho thí nghiệm lai?
Ngoài thông tin đưa ra sau đây và kinh nghiệm riêng của bạn, đường hướng tin tưởng nhất để xác định loại màng có thể sử dụng trong ứng dụng của bạn hay không là hỏi nhà sản xuất dữ kiện về chất lượng và ứng dụng. Loại màng mới có thể mang lại các kết quả khả quan hay không chỉ có thể được quyết định bằng thực nghiệm. Kết quả này còn phụ thuộc vào sự phối hợp khác nhau của đích, mẫu dò, và chiến lược xác định.

Độ bền vật lý
Nitrocellulose khá phổ biến trong những ứng dụng có độ nhạy thấp tới trung bình và trong trường hợp thao tác bằng tay. Độ bền cơ học của nylon càng lớn càng làm cho chúng phù hợp hơn khi cần thao tác nhiều lần trên blot. Có thể dò mẫu trên tấm lọc nylon ít nhất 10 lần (Krueger và Williams, 1995; Li, Parker, và Kowalik, 1987). Mặc dù có thể sử dụng nitrocellulose nhiều lần nhưng nó ít được lựa chọn để tái sử dụng do tính dễ vỡ, mất đích liên kết cộng hóa trị khi rửa, và độ bền giảm khi rửa mạnh. Hỗ trợ bằng bản thủy tinh và chip (chip là những mảnh vuông nhỏ và được gắn lên bản thủy tinh khi thực hiện thí nghiệm lai) có thể rửa được, nhưng hiệu quả rửa và sự hóa già của đích khi có hỗ trợ này có thể ảnh hưởng tới việc tái sử dụng sau hai hay ba lần tháo khuôn và tái dò. Nitrocellulose được hỗ trợ như trên rất vững chắc và dễ thao tác hơn, nhưng lưu ý rằng phải sử dụng theo đúng cách.

Khả năng liên kết
Màng Nylon và PVDF (polyvinylidene difluoride) liên kết tốt với nucleic acid hơn nitrocellulose nên có thể phát tín hiệu mạnh hơn sau khi lai. Các nucleic acid liên kết cộng hóa trị với nylon nhưng không liên kết với nitrocellulose. Nylon tích điện dương cho khả năng liên kết cao nhất. Đây là trường hợp hệ thống xác định có độ nhạy càng lớn, khả năng liên kết của màng tích điện dương càng lớn và có thể làm tăng nguy cơ tín hiệu nền. Tuy nhiên, việc tối ưu các điều kiện lai, như nồng độ mẫu dò và thành phần đệm lai, thường ngăn chặn được những vấn đề nền. Nếu không được, người ta có thể yêu cầu chuyển sang loại màng khác, như màng nylon trung tính. Nếu tín hiệu của bạn quá yếu, hãy thử màng nylon tích điện dương. Người ta thường chọn nylon tích điện dương cho ứng dụng phi phóng xạ để đạt độ bền tín hiệu lớn nhất. Lượng điện tích dương (và điện thế nền) có thể biến đổi 10 lần giữa các nhà sản xuất. Khả năng liên kết của nitrocellulose thấp làm giảm vấn đề nền khi phát sinh tín hiệu có thể thu nhận được.

Độ dày
Hầu hết các màng có độ dày khoảng 100-150 µm. Độ dày ảnh hưởng tới lượng dung dịch đệm cần thiết tính trên một cm vuông. Màng càng dày càng thấm nhiều đệm, thấm lâu, và khó áp dụng những ứng dụng khô vào màng lọc dày trên bề mặt gel.

Kích thước lỗ
Kích thước lỗ hạn chế kích thước của đoạn nhỏ nhất có thể liên kết và cố định trong màng. Lưu ý rằng kích thước lỗ là một giá trị trung bình. Nhìn chung, lỗ có kích thước 0.45µm có thể liên kết với oligonucleotide có độ dài nhỏ tới 50 base. Người ta khuyên nên dùng màng có kích thước lỗ 0.22µm khi làm việc với đoạn DNA mạch đơn hay kép nhỏ nhất. Người ta cũng cung cấp màng có kích thước lỗ 0.1µm. Bảng 14.1 so sánh đặc điểm của một số loại màng.

 

[happyfly]

Ứng dụng chuyên môn
Microarray
Bản thủy tinh khác biệt với tất cả các loại hỗ trợ màng khác bởi thủy tinh liên kết cộng hóa trị với nucleic acid định hướng, không xốp và tự phát huỳnh quang yếu. Giá không xốp làm giảm được thể thích đệm, từ đó sẽ giảm chi phí và cho phép tăng nồng độ mẫu dò. Không như màng nylon và nitrocellulose, nền không phải là vấn đề dưới điều kiện khắc nghiệt như thế. Mẫu dò đánh dấu bởi những chất nhuộm khác nhau và cho phép xác định nhiều đích chỉ trong một thí nghiệm lai; bản nylon ít được sử dụng khi lai theo chuỗi hoặc song song, mặc dù có tài liệu tham khảo về việc xác định liên tục trên màng nylon. (Một số tài liệu tham khảo cho nhiều mẫu dò trên nylon là của Kondo và cs.(1998), Holtke và cs. (1992),và Bertucci và cs.(1999).). Những đặc điểm này làm cho bản thủy tinh lý tưởng khi xác định phi phóng xạ trong microarray.

Macroarray
Những vấn đề nền, thể tích đệm lớn, và chi phí hạn chế tác dụng của chất đánh dấu khi áp dụng macroarray trên màng lọc nylon. Macroarray cần màng nylon tích điện thấp hoặc không tích điện để giảm thể tích đệm tiêu tốn nhưng lại có độ nhạy thấp do màng nylon tự phát huỳnh quang mạnh. Tín hiệu mạnh hơn phát từ phản ứng enzyme-cơ chất khuếch đại tín hiệu ảnh hưởng xấu tới quá trình phân tích và định lượng. Người ta thường sử dụng chất đánh dấu phóng xạ như P33 hơn trong macroarray (Moichi và cs., 1999; Yano và cs., 2000; Eickhoff và cs., 2000).

Loại màng nào phù hợp nhất với thí nghiệm định lượng?
Kích thước của nucleic acid được chuyển lên màng lai, tính chất vật lí của màng, và thành phần của đệm chuyển ảnh hưởng tới hiệu quả chuyển. Không có quy tắc nhất định đảm bảo cho việc chuyển tuyến tính (linear transfer) tất cả nucleic acid tại mọi thời điểm. Cần kiểm tra theo kinh nghiệm việc chuyển tuyến tính bằng nhiều độ pha loãng theo thang phân tử lượng nucleic acid (marker).

Làm thế nào để biết màng còn hoạt động tốt?
Màng sẽ ghi lại tất cả các loại dấu, hạt bột, vụn hay nếp gấp. Luôn thao tác màng bằng kẹp nhựa và găng tay không bột.

Nêng giữ màng khô và đồng nhất. Tránh gấp hay làm xước bởi phá hủy cơ học sẽ dẫn tới vấn đề nền tại vị trí đó. Nên làm ẩm màng liên tục và nhanh. Tốt nhất không sử dụng màng khi màng xuất hiện đốm/chấm, hay có màu khác. Màng dễ thấm nước, nhạy ánh sáng, và dễ bị phá hủy nhưng vẫn giữ đúng chức năng sau hàng năm nếu bảo quản đúng cách. Hãy chú ý nhà sản xuất chỉ bảo hành trong thời gian ngắn, thường từ 6-12 tháng. Nếu nghi ngờ về hoạt động của màng, có thể kiểm tra bằng một thí nghiệm nhanh về lai điểm hoặc khả năng liên kết. Nhà sản xuất có thể cung cấp hướng dẫn để đánh giá khả năng liên kết. Sử dụng một màng nhỏ không chứa đích và chưa xử lí để đánh giá nền trong đệm lai và hệ thống rửa đã áp dụng có thể giúp khắc phục vấn đề nền.

 

[happyfly]

Có thể khử trùng màng nylon và nitrocellulose?
Các nhà nghiên cứu thực hiện lai colony thường băn khoăn về việc khử trùng màng. Trong khi các nhà cung cấp không đảm bảo về việc màng có thể khử trùng được, người ta sản xuất và đóng gói rất cẩn thận để giảm tối đa nguy cơ nhiễm. Về mặt lí thuyết, vẫn có thể khử trùng màng trong nồi hấp nhưng chỉ trong thời gian rất ngắn (hai phút ở 121°C trong chu kì lỏng (liquid cycle)). Lưu ý rằng khoảng thời gian này không đủ để khử trùng hoàn toàn. Nên đưa màng ra ngoài ngay khi nồi hấp xuống tới nhiệt độ an toàn, và sau đó làm khô màng ở nhiệt độ phòng. Nên phân tách màng (trong tập nhiều màng) bằng giấy Whatman. Chú ý rằng màng lọc có thể chuyển màu nâu, trở nên dễ vỡ, có thể co và vênh và khó để xếp lên bề mặt, nhưng sẽ không ảnh hưởng tới việc lai với mẫu dò.

Có thể khử trùng màng lọc bằng cách xử lí màng với 15% peroxide hoặc 98% ethanol tại nhiệt độ phòng sau khi liên kết chéo. Peroxide có thể tổn hại nucleic acid và hóa tính của màng.

SỰ TRUYỀN NUCLEIC ACID
Vấn đề nào ảnh hưởng tới việc chuyển nucleic acid từ gel agarose?
Phần này sẽ tập trung vào việc chuyển bị động nucleic acid từ gel agarose lên màng. Chi tiết về việc chuyển DNA từ gel polyacrylamide được giới thiệu trong Westermeier (1997).

Kĩ thuật chủ động hay bị động
Phương pháp chuyển chân không, điện di, và trọng lực nhanh (ít hơn 3 giờ) và hiệu quả (chuyển được trên 90%). Hiệu quả việc chuyển phụ thuộc vào độ dày bản gel, nồng độ gel và nồng độ hay kích thước nucleic acid. Thời gian chuyển tăng theo nồng độ agarose, độ dày bản gel, và kích thước đoạn nucleotide. Lai mao dẫn RNA lớn hơn 2.5kb mất hơn 12 giờ, và chuyển nghịch chỉ mất 1-3 giờ (Ming và cs.,1 994; Chomczynski,1992; Chomczynski và Mackey, 1994). Việc chuyển nghịch phổ biến để chuyển RNA bởi nó nhanh, chi phí thấp, không làm nát gel, và chuyển kiềm (alkaline transfer) hiệu quả (Inglebrecht, Mandelbaum, và Mirkov, 1998).

Dung dịch đệm chuyển
Nhà sản xuất tấm lọc và thiết bị lai cung cấp protocol chuyển có thể sử dụng để làm dịch đệm chuyển lúc ban đầu. Nếu kích thước và trình tự nucleic acid không bình thường, có thể cần thay đổi protocol. RNA, mảnh DNA nhỏ (<100bp), và các loại màng nitrocellulose thường yêu cầu nồng độ muối cao hơn. Hãy nhớ rằng RNA có ái lực rất thấp với nitrocellulose ngay cả khi nồng độ muối cao.

 

[happyfly]

pH ảnh hưởng nhiều và phức tạp lên hiệu quả chuyển và việc xác định đích sau đó. pH đệm chuyển có thể trực tiếp ảnh hưởng tới độ ổn định của màng và đích nucleic acid. Màng nitrocellulose và màng nylon không bền tại pH>9, và nitrocellulose sẽ không liên kết DNA tại pH>9 (Ausubel và cs., 1993). Một số màng nylon không bền tại pH acid (Wheeler, 2000). pH đệm chuyển cũng có thể ảnh hưởng tới tín hiệu ra và nền, đặc biệt khi thực hiện với màng nylon (Price, 1996; McCabe và cs., 1997).

pH đệm chuyển cũng có thể ảnh hưởng tới điện tích bề mặt của màng. Màng nylon là polyamide. Điện tích thực của màng nylon khi chưa bị biến đổi là 0, nhưng khi pH giảm, khung polyamide sẽ tích điện dương. Các nhóm bên khác nhau đưa vào thành phần màng nylon để tăng điện tích dương hay âm của màng. Những nhóm này có thể làm thay đổi đáp ứng màng với pH đệm chuyển, từ đó sẽ ảnh hưởng tới khả năng liên kết của mẫu dò với đích nucleic acid. Khi sử dụng đệm chuyển có tính acid hay kiềm, bạn nên xác nhận lại ảnh hưởng của pH lên màng cụ thể định sử dụng. Tham khảo Khandjian (1985) để tìm hiểu thêm về ảnh hưởng pH và nồng độ muối.

Điều kiện chuyển kiềm sẽ bẻ gãy và biến tính nucleic acid. Người ta có khai thác những ảnh hưởng này khi lai chéo DNA sau khi chuyển. Phơi RNA lâu trong kiềm yếu (pH>9) sẽ phân hủy RNA, nhưng Inglebrecht, Mandelbaum, và Mirkov (1998) đã sử dụng pH kiềm trong thời gian ngắn để tăng hiệu quả chuyển khi việc chuyển RNA gặp khó khăn hay khi RNA có kích thước lớn. Một số nhà sản xuất màng khuyến cáo không nên chuyển kiềm RNA và DNA bởi kết quả tạo ra không đồng bộ. Nếu bản gel đã khử purin trước khi chuyển kiềm hay phi kiềm, việc bỏ qua bước trung hòa trước khi chuyển có thể làm giảm tín hiệu. Khi không có bước trung hòa, việc khử purin sẽ tiếp diễn trên bản gel.

Việc khử purin
Bẻ gãy nucleic acid bằng khử purin làm tăng hiệu quả chuyển. Khi đích lớn hơn 5 kb, nồng độ agarose lớn hơn 1%, và độ dày bản gel lớn hơn 0.5cm hiệu quả chuyển tăng nhờ khử purin. Khử purin quá thời gian đề nghị sẽ làm giảm độ nhạy khi lai.

Chất nhuộm
Có thể nhuộm bản gel và/hoặc màng để kiểm tra hiệu quả chuyển. Tuy nhiên sẽ không thể tuyệt đối khẳng định rằng chất nhuộm có cản trở việc chuyển và lai sau đó hay không. Chất nhuộm xen vào giữa liên kết, như ethidium bromide hay methylene blue, có thể ảnh hưởng tới việc chuyển và hiệu quả lai (Thurston và Saffer, 1989; Ogretmen và cs., 1993). Booz (2000) lại công bố rằng thí nghiệm lai Southern không đưa ra ảnh hưởng nào của ethidium bromide. Trong trường hợp khác, ethidium bromide cản trở việc chuyển bởi ảnh hưởng lên sự siêu tích điện của màng nylon (Amersham Pharmacia Biotech, theo những quan sát chưa công bố). Chất nhuộm DNA thường là cation xen vào giữa liên kêt; do đó nồng độ muối cao ảnh hưởng tới hiệu quả gắn. Do vậy nồng độ muối cao của đệm chuyển cũng có thể ảnh hưởng tới việc chuyển và lai sau đó. Tuite và Kelly (1993) cũng đưa ra tính cản trở lên quá trình lai sau khi nhuộm methylene blue.

Một số chất nhuộm mới (SYBRGold và SYBR Green, Molecular Probes Inc.) được quảng cáo là không ảnh hưởng tới quá trình chuyển và lai. Nhưng như đã được mô tả phía trên, tốt nhất là không nhuộm gel trước khi chuyển, hoặc chỉ nhuộm giếng marker. Người ta đã thực hiện được việc quan sát DNA trên màng bằng by UV shadowing nhưng vẫn thấy tồn tại vấn đề về độ nhạy kém, và liên kết quá chặt của nucleic acid (Thurston và Saffer, 1989; Herrera và Shaw, 1989).

Tham khảo chi tiết về nhuộm theo tài liệu của Wilkinson, Doskow, và Lindsey (1991), Wade và O’Conner (1992), Correa-Rotter, Mariash, và Rosenberg, 1992) và tại http://www.mrcgene.com/met-blue.htm, http://www.cbs.umn.edu/~kclark/protocols/transfer.html, http://www. bioproducts.com/technical/visualizingdnainagarosegels.shtml.

Vấn đề về vật lý
Bóng khí giữa bản gel và màng, giữa màng và tấm lọc, giữa bản gel và hỗ trợ (thí dụ giá thủy tinh) sẽ cản trở việc chuyển. Phần gel bị ép hay có bề mặt khô sẽ giữ nucleic acid. Di chuyển màng cùng với bản gel ngay khi quan sát thấy hình in,bóng và/hoặc băng mờ khi việc chuyển vừa bắt đầu.

Nên giữ màng ẩm hay khô trước khi sử dụng?
Tốt nhất là theo hướng dẫn của nhà sản xuất dành riêng cho màng và thiết bị lai của bạn bởi từng nhà cung cấp có chiến lược khác nhau.

Nhìn chung, cân bằng màng và bản gel trước có lợi cho việc chuyển mao dẫn. Việc gel và màng trôi tự do trong đệm dư giúp cân bằng tới điều kiện để việc chuyển diễn ra hiệu quả, từ đó có thể giảm thời gian chuyển. Người ta cũng xét tới tính đơn giản của ứng dụng màng; một số nhà nghiên cứu thích áp dụng màng ẩm lên gel, nhưng là do sở thích cá nhân.

Nếu thích làm ẩm trước, nên làm ẩm nitrocellulose cũng như nylon trong nước chưng cất trước. Màng sẽ ẩm nhanh và đều hơn nếu không có muối.
Hầu như không cần làm ẩm trước màng khi lai điểm. Điểm có thể bị lan rộng nếu màng ẩm. Lai điểm và/hoặc đường sẽ thấm đều hơn khi áp dụng trên màng khô. Việc điểm lan không đều do màng ẩm không đều hoặc màng ẩm có thể dẫn tới dạng hoa thị thay vì vòng tròn hay ô vuông.

Tối ưu hóa việc chuyển khuẩn lạc và mảng như thế nào (Colony and Plaque Transfer)?
Khuẩn lạc hay mảng đơn thường chứa hàng triệu bản sao đích, nên việc chuyển đáp ứng dường như kém hiệu quả hơn. Bước xử lý sodium hydroxide/SDS giúp phân giải tế bào và biến tính DNA. Bước này cũng làm nhiệm vụ cố định được nếu sử dụng màng tích điện dương. Hoàn thành quá trình lai bằng bước trung hòa và cân bằng tấm lọc trong đệm muối như SSC trước khi cố định. Sau đó có thể thực hiện chuyển cùng với việc sử dụng proteinase K để loại bỏ mảnh vụn và giảm nền (Kirii, 1987; Gicquelais và cs., 1990). Bước xử lý bằng proteinase K sẽ giảm tín hiệu nền trong hệ thống xác định phi phóng xạ, đặc biệt với hệ thống dựa trên alkaline phosphatase. Có thể loại xác vi khuẩn bằng cách rửa bằng đệm cân bằng - làm sạch mô bão hòa. (Bacterial debris can also be removed mechanically by gentle scrub bing with equilibration buffer-saturated tissue wipes).

Khuẩn lạc hay mảng có đường kính lý tưởng là nhỏ hơn 1mm; trong đó khuẩn lạc nhỏ hơn 0.5mm đưa ra tín hiệu tập trung hơn (http://www.millipore.com/analytical/pubdbase.nsf/docs/
TN1500ENUS.html). Nên đặt khuẩn lạc nằm phía trên tấm lọc (Filters should be “colony side up”) suốt trong quá trình biến tính/trung hòa. Người ta đưa ra hai phương pháp khác nhau để xử lý tấm lọc: phương pháp nhúng, là thả nổi hay nhúng tấm lọc vào đệm, và phương pháp bấc, khi bão hòa giấy 3MM Whatman trong đệm. Phương pháp bấc tạo điểm rõ ràng và tập trung hơn; phương pháp nhúng thường gây biến tính và mất tín hiệu. Trong nhiều protocol mới, người ta bỏ qua bước biến tính/trung hòa và sử dụng sóng viba (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_169.html) hoặc protocol khử trùng/liên kết chéo (http://www.jax.org/~jcs/
techniques/protocols/ColonyLifts.html). Mặc dù những kĩ thuật này khó tối ưu nhưng tiết kiệm thời gian. Tuy nhiên, sóng viba có thể làm cong màng, gây khó khăn khi xếp tấm lọc vào bản agar ban đầu.

 

[hoangkhai]

Em mới tham gia vào diễn đàn
Cho em hỏi quyển sách này sau khi dịch xong có thể chia sẻ cho các thành viên của SHVN được không?