Nhiệt độ trong PCR

[caibinhbong]

Các anh chị ơi giúp bọn em với.

Thầy em cho em hai cái chương trình PCR như thế này

CT1

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 45 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT2

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 52 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT 2 giống CT1 chỉ khác là nhiệt độ kết dính là 52 độ thay vì 45 độ.

Thầy hỏi là giải thích cơ sở chọn lựa nhiệt độ ở quá trình kết dính, khi nào chọn nhiệt độ cao, khi nào chọn nhiệt độ thấp (ví dụ như 52 và 45 độ như ở trên).


Thầy còn có thêm bài tập là cơ sở hoạt động của máy đọc trình tự LiCor và ABI3730. Em có biết gì về hai máy này đâu.


Các anh chị giúp bọn em với nhá.

 

[Dương Văn Cường]

Nếu bỏ qua yếu tố điều kiện môi trường (thường buffer của DNA polymerase được tính toán theo chuẩn chung) thì nhiệt độ "kết dính" phụ thuộc vào độ dài và trình tự mồi. Cách tính cụ thể dư lào thì cop pết primer sequence vào máy tính nó tính cho.

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 52 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

Nếu có điều kiện thì em hỏi lại thầy xem cơ sở nào mà thầy chọn mấy con số anh bôi đỏ ý :bithuong:

 

[caibinhbong]

Cái này thì em biết, nhiệt độ phụ thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuyếch đại, ở nhiệt độ thầy em cho thì đoạn DNA này khoảng từ 1,2 đến gần 2kb.

Nhưng trả lời như anh nói là phụ thuộc độ dài và trình tự mồi thì trên lớp bạn em trả lời rồi nhưng thầy cười và lắc đầu và bảo đó là mấy con vẹt trả lời theo sách

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Phụ thuộc nhất vào người đặt nhiệt độ

 

[caibinhbong]

Là sao em hổng hiểu?

 

[Dương Văn Cường]

Cái này thì em biết, nhiệt độ phụ thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuyếch đại, ở nhiệt độ thầy em cho thì đoạn DNA này khoảng từ 1,2 đến gần 2kb.

Nhưng trả lời như anh nói là phụ thuộc độ dài và trình tự mồi thì trên lớp bạn em trả lời rồi nhưng thầy cười và lắc đầu và bảo đó là mấy con vẹt trả lời theo sách

:mygod:

Nếu anh không nhầm thì ý của thầy em là "Nhiệt độ gắn mồi (mà ở lớp em gọi là "nhiệt độ kết dính") phụ thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuếch đại".

Cái gọi là "KHOẢNG" của thầy em quả thực là

Bao giờ thầy có lời giải em post lên đây nhé. Anh tha thiết mong chờ đáp án của thầy em. Giờ thì cho anh xin phép đi ngủ không thì vợ anh lại mắng là đồ con vẹt chỉ biết trả lời theo sách chả biết "mần ăn" gì

 

[Nguyễn Đôn]

phụ thuộc độ dài và trình tự mồi thì trên lớp bạn em trả lời rồi nhưng thầy cười và lắc đầu và bảo đó là mấy con vẹt trả lời theo sách

Hình như mình cũng là vẹt

Có thể thầy của bạn muốn liệt kê hết tất cả những thứ có liên quan. Nếu vậy thì bạn có thể kể:
- Thành phần nucleotide và độ dài của mồi
- Thành phần nucleotide và độ dài của sản phẩm
- Thành phần nucleotide và độ dài của mẫu (template)
- Loại polymerase được sử dụng
- Nồng độ DNA trong phản ứng
- Nồng độ muối trong phản ứng
- v.v...

Những thứ này đều đã được công thức hoá cả. Những công thức này có liên quan đến các hàm entropy, enthalpy và logarithm.

Mỗi lần làm thí nghiệm, các "nhà" sinh học thường không thích tính toán lôi thôi, nên họ đơn giản hoá bằng cách thiết lập một loạt thí nghiệm gọi là PCR theo thang nhiệt độ (gradient PCR) có các nhiệt độ bắt cặp DNA khác nhau, sau đó sẽ biết nhiệt độ nào là tối ưu.

Như vậy vẫn chưa đủ đơn giản cho các nhà sinh học, họ mới đơn giản hoá nữa là cứ canh theo nhiệt độ biến tính (Tm = melting temperature) của đoạn mồi có Tm nhỏ hơn mà chọn nhiệt độ bắt cặp, cái này thì tuỳ loại polymerase mà chọn cho thích hợp. Tóm lại, chủ yếu thì người ta thích làm "vẹt", chỉ dựa theo:
- Độ dài và thành phần nucleotide của mồi
- Loại polymerase
- Và tuỳ theo người đặt nhiệt độ (Nguyên Xuân Hưng, 2009)
Khi nào gặp phải PCR khó xơi thì người ta mới lần mò trở lại PCR theo thang nhiệt độ, còn hình như tôi chưa thấy ai phải mò lại đến tận các công thức entropy với enthalpy kia.

Cái này thì em biết, nhiệt độ phụ thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuyếch đại, ở nhiệt độ thầy em cho thì đoạn DNA này khoảng từ 1,2 đến gần 2kb.

Cái vụ chọn thời gian cho phản ứng coi chừng cũng thành "vẹt".
Nếu thầy đã muốn học trò "đả" vẹt cho nhiệt độ bắt cặp, thì học trò cũng nên loại bỏ vẹt trong việc chọn thời gian phản ứng.
Thời gian cho PCR cũng phụ thuộc vào:
- Độ dài của sản phẩm
- Bản chất của mẫu
- Và người đặt thời gian

 

[changtraixua]

Phụ thuộc chủ yếu vào người đặt nhiệt độ
Không biết thầy em giải thế nào? Nhớ post bài của thầy lên cho anh em tham khảo nhé.
Sắp thoát kiếp con vẹt rùi

 

[caibinhbong]

Cám ơn các anh chị, sáng nay em đã hỏi thăm thầy em, thầy em gợi ý là câu trả lời nằm trong cái công thức Ta và Tm, thầy bảo quan hệ giữa hai công thức này, kết quả band xuất hiện khi chạy điện di và thậm đặc tính mơ hồ của mồi và khuôn sẽ giúp người ta quyết định tăng hay giảm nhiệt độ kết dính. Tại thầy em bận quá nên em không hiểu hết, mong anh chị giúp em.

À, còn câu hỏi về Li-Cor và ABI3730 có anh chị nào biết trả lời cho em với.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Cám ơn các anh chị, sáng nay em đã hỏi thăm thầy em, thầy em gợi ý là câu trả lời nằm trong cái công thức Ta và Tm, thầy bảo quan hệ giữa hai công thức này, kết quả band xuất hiện khi chạy điện di và thậm đặc tính mơ hồ của mồi và khuôn sẽ giúp người ta quyết định tăng hay giảm nhiệt độ kết dính. Tại thầy em bận quá nên em không hiểu hết, mong anh chị giúp em.

À, còn câu hỏi về Li-Cor và ABI3730 có anh chị nào biết trả lời cho em với.

Thôi rồi Lượm ơi, bà con lại sắp xúm vào cho xem. Tớ đứng ngoài nhìn thôi nhé.

@Đôn: trích dẫn đáo để nhỉ, đi luyện chụp ảnh wedding đê

 

[Dương Văn Cường]

Có thể thầy của bạn muốn liệt kê hết tất cả những thứ có liên quan. Nếu vậy thì bạn có thể kể:
- Thành phần nucleotide và độ dài của mồi
- Thành phần nucleotide và độ dài của sản phẩm
- Thành phần nucleotide và độ dài của mẫu (template)
- Loại polymerase được sử dụng
- Nồng độ DNA trong phản ứng
- Nồng độ muối trong phản ứng

@Đôn: Ở đây đang bàn về annealing temp cơ mà.

 

[Dương Văn Cường]

Cám ơn các anh chị, sáng nay em đã hỏi thăm thầy em, thầy em gợi ý là câu trả lời nằm trong cái công thức Ta và Tm, thầy bảo quan hệ giữa hai công thức này, kết quả band xuất hiện khi chạy điện di và thậm đặc tính mơ hồ của mồi và khuôn sẽ giúp người ta quyết định tăng hay giảm nhiệt độ kết dính. Tại thầy em bận quá nên em không hiểu hết, mong anh chị giúp em.

À, còn câu hỏi về Li-Cor và ABI3730 có anh chị nào biết trả lời cho em với.

Em học cấp 3 hay đại học?

 

[caibinhbong]

Em đang học Đại học cơ.

 

[Lê Đức Dũng]

hôm sau muốn hỏi thầy cái gì thì cầm cài phong bì theo, chìa phong bì trước hỏi sau, kiểu gì cũng nhạn được câu trả lời đầy đủ

 

[Huỳnh Như Ngọc Hiển]

Các anh chị ơi giúp bọn em với.

Thầy em cho em hai cái chương trình PCR như thế này

CT1

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 45 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT2

Biến tính 95 dộ trong 3 phút,
Chạy 30 vòng theo thông số sau:
- Biến tính 95 độ trong 2 phút
- kết dính 52 độ trong 2 phút
- tổng hợp ở 68 độ trong 3 phút

CT 2 giống CT1 chỉ khác là nhiệt độ kết dính là 52 độ thay vì 45 độ.

Thầy hỏi là giải thích cơ sở chọn lựa nhiệt độ ở quá trình kết dính, khi nào chọn nhiệt độ cao, khi nào chọn nhiệt độ thấp (ví dụ như 52 và 45 độ như ở trên).


Thầy còn có thêm bài tập là cơ sở hoạt động của máy đọc trình tự LiCor và ABI3730. Em có biết gì về hai máy này đâu.


Các anh chị giúp bọn em với nhá.

Thực hiện 30 chu kì PCR có thể do sử dụng Taq pol. Taq pol có thời gian bán hoạt động là 30 phút ở 95 độ c.

Ban đầu thời gian biến tính là 3 ph có thể do hàm lượng GC cao, sau đó biến tính trong 2 ph do sản phẩm PCR khuyếch đại sau chu kì thứ nhất có độ dài ngắn hơn so với DNA khuôn mẫu ban đầu.

Bước tổng hợp có nhiệt độ và thời gian tổng hợp chuẩn là 70 -72 độ c trong 0.5 - 3 ph. Ở khoảng 70 độ c, taq có hoạt tính tối thích và kéo dài mồi xảy ra với tốc độ 100 nu/giây. Có thể sản phẩm kích thước bằng hoặc trên 3 kb nên thời gian tổng hợp sản phẩm là 3 ph.

Bước gắn mồi (kết dính): thời gian gắn mồi kéo dài 2 ph là đủ. Nhiệt độ nóng chảy sợi kép DNA tăng theo độ dài mồi và hàm lượng GC, bước gắn mồi ở đây chịu ảnh hưởng trực tiếp của hàm lượng GC và độ dài mồi. Nhiệt độ bắt cặp Ta thường thấp hơn 5 độ c so với Tm của cặp mồi sử dụng. Phải xử lí Ta nếu tính đặc hiệu và hiệu suất thu sản phẩm khuếch đại PCR có vấn đề. Nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thì phải tăng từng bước lên 1-2 độ c.

Có một số công thức tính nhiệt độ nóng Tm, công thức chung nhất hay sử dụng là CT Wallace. Tùy theo kinh nghiệm mà dùng công thức nào. Nhiệt độ bắt cặp thực Ta có thể cao hơn 3-12 độ c so với Tm tính toán. Có thể suy đoán mồi dài từ 16 -18 nu theo wallace...

Sách vở là vậy đó

 

[caibinhbong]

Em cám ơn anh Hiển nhiều lắm lắm, vậy mình chạy 3 phút ở giai đoạn kết dính là khi GC cao hay thấp hả anh? cái hàm lượng GC này là của mồi hay của khuôn vậy anh?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

thầy khen tụi em vẹt nhanh giống thầy đó.
Cam đoan thầy này chưa chạy PCR bao giờ. annealing time làm gì tới cả phút thế?

 

[Nguyễn Đôn]

Có thể thầy của bạn muốn liệt kê hết tất cả những thứ có liên quan. Nếu vậy thì bạn có thể kể:
- Thành phần nucleotide và độ dài của mồi
- Thành phần nucleotide và độ dài của sản phẩm
- Thành phần nucleotide và độ dài của mẫu (template)
- Loại polymerase được sử dụng
- Nồng độ DNA trong phản ứng
- Nồng độ muối trong phản ứng

@Đôn: Ở đây đang bàn về annealing temp cơ mà.

Thường thì người ta chỉ xem xét thành phần nucleotide và độ dài của mồi để quyết định nhiệt độ bắt cặp. Nhưng do thầy của bạn caibinhbong "chê" rằng như vậy là vẹt, nên em mới liệt kê hết các thành phần có tác động theo lý thuyết.

Theo lý thuyết thì tất cả những thứ em liệt kê ở trên đều có tác động đến nhiệt độ biến tính (Tm) của mẫu, của sản phẩm, và của mồi.
Rồi các Tm này sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt cặp tối ưu của PCR.

Những công thức này rất loằng ngoằng, có liên quan đến entropy, enthalpy và logarithm như em đã nói ở trên.

Những thứ này được ghi rõ trong bài báo:
Rychlik W. et al. (1990) Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro. Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412.

Riêng em thì em chỉ thích làm "vẹt", nên không dùng các công thức trong bài báo trên.

 

[Dương Văn Cường]

Thực hiện 30 chu kì PCR có thể do sử dụng Taq pol. Taq pol có thời gian bán hoạt động là 30 phút ở 95 độ c.

Ban đầu thời gian biến tính là 3 ph có thể do hàm lượng GC cao, sau đó biến tính trong 2 ph do sản phẩm PCR khuyếch đại sau chu kì thứ nhất có độ dài ngắn hơn so với DNA khuôn mẫu ban đầu.

Bước tổng hợp có nhiệt độ và thời gian tổng hợp chuẩn là 70 -72 độ c trong 0.5 - 3 ph. Ở khoảng 70 độ c, taq có hoạt tính tối thích và kéo dài mồi xảy ra với tốc độ 100 nu/giây. Có thể sản phẩm kích thước bằng hoặc trên 3 kb nên thời gian tổng hợp sản phẩm là 3 ph.

Bước gắn mồi (kết dính): thời gian gắn mồi kéo dài 2 ph là đủ. Nhiệt độ nóng chảy sợi kép DNA tăng theo độ dài mồi và hàm lượng GC, bước gắn mồi ở đây chịu ảnh hưởng trực tiếp của hàm lượng GC và độ dài mồi. Nhiệt độ bắt cặp Ta thường thấp hơn 5 độ c so với Tm của cặp mồi sử dụng. Phải xử lí Ta nếu tính đặc hiệu và hiệu suất thu sản phẩm khuếch đại PCR có vấn đề. Nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thì phải tăng từng bước lên 1-2 độ c.

Có một số công thức tính nhiệt độ nóng Tm, công thức chung nhất hay sử dụng là CT Wallace. Tùy theo kinh nghiệm mà dùng công thức nào. Nhiệt độ bắt cặp thực Ta có thể cao hơn 3-12 độ c so với Tm tính toán. Có thể suy đoán mồi dài từ 16 -18 nu theo wallace...

Sách vở là vậy đó

Có vài chi tiết trong bài của Hiển cần đính chính.

Đỏ: Bước biến tính đầu tiên thường là 5 phút ngoài lý do "có thể hàm lượng GC cao" còn bởi vì:

1. Người ta không sure lắm về chất lượng DNA khuôn ban đầu sau khi tách chiết hoặc lấy từ trạng thái đông lạnh ra. Có thể có các protein bám DNA, các chất tạp nhiễm, và cả các yếu tố trời ơi đất hỡi nào đó làm ảnh hưởng đến khả năng biến tính của DNA.
2. DNA khuôn ban đầu thường có độ dài lớn hơn rất nhiều lần so với đoạn gene đích cần khuếch đại. Ví dụ template là DNA genome thì độ dài của 1 sợi DNA NST lớn hơn hàng nghìn lần đoạn DNA đích, hay thậm chí plasmid cũng lớn hơn 5-10 lần so với target fragment. Hơn nữa như Hiển đã đề cập đó là thành phần GC trên các khu vực DNA có thể khác nhau.

Do đó cần xử lý "mạnh tay" ở 94-95 độ C trong 5 hoặc 10 phút để đảm bảo DNA khuôn ban đầu được biến tính hoàn toàn.

Xanh: Ở bước tổng hợp, có 2 yếu tố cần setup là Nhiệt độ và Thời gian.

Nhiệt độ: Phụ thuộc sử dụng loại DNA polymerase nào. Cái này thì tra bảng cho nó chuẩn nhé.

Thời gian: Phụ thuộc sử dụng loại DNA polymerase nào và chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại. DNA polymerase là cái ô tô có vận tốc nhât định, chiều dài đoạn DNA cần khuếch đại là quãng đường. Tính thời gian để ô tô có vận tốc 100km/h đi hết quãng được 500km. Cái này toán lớp 5-6 gì đó học mãi rồi mọi người nhỉ.

Con số 100 nu/giây Hiển đưa ra theo tài liệu nào? Mình cung cấp 1 dữ liệu trong cuốn Analysis of Genes and Genomes của Richard J. Reece trang 161. Mời anh em xem hình đính kèm.

Một chi tiết nữa là người ta rất ít khi dùng taq để khuếch đại đoạn dài 3kb vì tỉ lệ lỗi sẽ khá cao.

Vàng: Bước gắn mồi mà bạn chủ topic đang thắc mắc.

@Đôn: Thực ra không biết khi Đôn liệt kê 1 loạt các yếu tố ra thì ý của Đôn là các yếu tố đó liên quan đến toàn bộ phản ứng PCR hay liên quan trực tiếp đến nhiệt độ gắn mồi?

Mình chưa bao giờ đọc được ở đâu là ĐỘ DÀI SẢN PHẨM PCR ảnh hưởng đến nhiệt độ gắn mồi cả. Chỉ có ĐỘ DÀI VÀ TRÌNH TỰ MỒI mới ảnh hưởng đến nhiệt độ gắn mồi. Nếu mình sai nhờ Đôn giải thích giùm.

Mình đồng ý với những gì Hiển viết ở cái đoạn mầu vàng trừ chi tiết "2 phút là đủ". Không có ai setup 2 phút gắn mồi vì chỉ cần 30s - 45s đã là quá đủ. Một điều quan trọng của phản ứng PCR là tổng thời gian phản ứng càng ngắn càng tốt. Thời gian càng dài thì DNA polymerase càng bị ảnh hưởng nhiều và tỉ lệ mắc lỗi trên sản phẩm PCR càng cao. Chính vì vậy khi làm thí nghiệm người ta luôn cố gắng setup thời gian cho từng bước ngắn nhất có thể, cũng như khi chạy PCR mà sản phẩm được đem đi giải trình tự thì thường chỉ chạy không quá 25 chu kỳ.


@ chủ topic: Nhìn cái PCR program mà thầy bạn đưa ra là đa số người có kinh nghiệm làm thí nghiệm không muốn tranh luận rồi. Đó là lý do vì sao anh Hưng bảo "Tùy thuộc nhất vào người đặt chương trình". Thầy bạn là 1 điển hình của việc dạy 1 môn học thực nghiệm mà không có kiến thức thực tế. Sở dĩ mình hỏi bạn học cấp 3 hay đại học vì nếu học cấp 3 thì còn có thể thông cảm, nhưng ở cấp đại học mà có những người thầy như vậy thì hơi buồn.

 

[Dương Văn Cường]

Post xong bài mới thấy bài reply trước của Đôn. Thanks nhiều! Bài báo đó sẽ rất hữu ích cho các thầy giáo khi giảng bài cho sinh viên. Còn đối với người làm thí nghiệm thì