Tách DNA từ lá đước (rừng ngập mặn Cần Giờ) để chạy RAPD

[Lâm Vỹ Nguyên]

Tách DNA từ lá đước (rừng ngập mặn Cần Giờ

Các bác ơi! Em cần tách được DNA từ cây đước để chạy RAPD nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể đước trong khu rừng ngập mặn Cần Giờ. Em ly trích hoài nhưng ko thấy cái DNA tổng số đâu cả. Đây là protocol em tiến hành. Mong các bác góp ý cho
- B1: Nghiền 0.15g lá + 1,2mililite EB.
- B2: Vortex kỹ và ủ 65[sup:ebb241b1ac]o[/sup:ebb241b1ac]C trong 45ph.
- B3: Thêm 500 microlite (ml) Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), vỏtex, ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC.
- B4: Lấy dịch trong, lập lại bước 3.
- B5: Lấy dịch trong, thêm 2ml RNase, ủ 37oC trong 1h (bước này hiện tại em chưa làm vì chưa có hóa chất).
- B6: Thêm 250ml isopropanol lạnh, để tủa ở -20oC trong 30ph.
- B7: Ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B8: Cho vào 300ml TE 1X, ủ 37oC trong 1h.
- B9: Thêm 20ml Sodium acetate 3M + 640ml ethanol 100%, trộn đều, để ở -20oC trong 30ph.
- B10: Ly tâm 14000vòng, 10ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B11: Rửa cặn với 400ml ethanol 70% bằng cách ly tâm 14000vòng, 2ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B12: Lập lại bước 11.
- B13: Để khô cặn, hòa tan cặn trong 70ml TE 1X, ủ 37oC trong 30ph.
- B14: Bảo quản mẫu ở -20oC.
Một số câu hỏi :
- Tại sao em làm theo quy trình này thì hiệu quả rất thấp trong khi cây xoài và cây điều thì cho ra kết quả rất tốt?
- Khi nghiền mẫu đước em thấy lá đước có độ nhớt rất cao (hơn cả lá điều). Đây có phải là lý do làm cho DNA khó kết tủa và dễ bị trôi ra trong quá trình rửa?
- Hiện tại ở Việt Nam đã có ai nghiên cứu về cây đước ở mức độ phân tử chưa?
Xin cám ơn các bác trước.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Re: Tách DNA từ lá đước (rừng ngập mặn Cần G

Các bác ơi! Em cần tách được DNA từ cây đước để chạy RAPD nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể đước trong khu rừng ngập mặn Cần Giờ. Em ly trích hoài nhưng ko thấy cái DNA tổng số đâu cả. Đây là protocol em tiến hành. Mong các bác góp ý cho
- B1: Nghiền 0.15g lá + 1,2mililite EB.
- B2: Vortex kỹ và ủ 65[sup:4fe0964393]o[/sup:4fe0964393]C trong 45ph.
- B3: Thêm 500 microlite (ml) Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), vỏtex, ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC.
- B4: Lấy dịch trong, lập lại bước 3.
- B5: Lấy dịch trong, thêm 2ml RNase, ủ 37oC trong 1h (bước này hiện tại em chưa làm vì chưa có hóa chất).
- B6: Thêm 250ml isopropanol lạnh, để tủa ở -20oC trong 30ph.
- B7: Ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B8: Cho vào 300ml TE 1X, ủ 37oC trong 1h.
- B9: Thêm 20ml Sodium acetate 3M + 640ml ethanol 100%, trộn đều, để ở -20oC trong 30ph.
- B10: Ly tâm 14000vòng, 10ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B11: Rửa cặn với 400ml ethanol 70% bằng cách ly tâm 14000vòng, 2ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.
- B12: Lập lại bước 11.
- B13: Để khô cặn, hòa tan cặn trong 70ml TE 1X, ủ 37oC trong 30ph.
- B14: Bảo quản mẫu ở -20oC.
Một số câu hỏi :
- Tại sao em làm theo quy trình này thì hiệu quả rất thấp trong khi cây xoài và cây điều thì cho ra kết quả rất tốt?
- Khi nghiền mẫu đước em thấy lá đước có độ nhớt rất cao (hơn cả lá điều). Đây có phải là lý do làm cho DNA khó kết tủa và dễ bị trôi ra trong quá trình rửa?
- Hiện tại ở Việt Nam đã có ai nghiên cứu về cây đước ở mức độ phân tử chưa?
Xin cám ơn các bác trước.

Protocol tách DNA của bạn là protocol thông dụng tách DNA mà mọi người vẫn dùng.

Tuy nhiên có vài điểm tui sẽ chỉnh sửa giúp bạn, phần tôi thêm vô sẽ giúp bạn tăng cơ hội thu DNA tổng số


- B1: Nghiền 0.15g lá + 1,2mililite EB.

EB của bạn chứa cái gì? CTAB, Sarkosyl, SDS??? tỷ lệ là bao nhiêu?


- B2: Vortex kỹ và ủ 65[sup:4fe0964393]o[/sup:4fe0964393]C trong 45ph.

Trong quá trình ủ, nên vortex vài lần, để phản ứng xảy ra trọn vẹn, cứ  vài phút thì vortex một lần.

Sau đó thì nên ly tâm 5 phút ở 3-4 ngàn rmp, 4-10oC.

Thu dịch nổi và ước lượng thể tích (gọi là V1)




- B3: Thêm 500 microlite (ml) Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), vỏtex, ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC.

Thể tích CI (Chloroform : isoamyl alcohol) phải bằng ?V1, nếu V1 là 1000 thì CI cũng phải 1000. Tỷ lệ này rất quan trọng.

Đừng vortex mà nên lắc bằng tay hoặc máy đảo (loại máy xoay tròn như cái đồng hồ) khoảng 5-10 phút. Vortex sẽ làm đứt gãy DNA.



- B4: Lấy dịch trong, lập lại bước 3.

Tại sao lại lấy dịch trong, viết chỗ này là kô rõ ràng. Khi CI và hỗn hợp dịch tế bào (đủ thú hằm bà lằng trong đó gồm cả DNA của bạn) phản ứng với nhau, dung dịch sẽ chia làm 2 pha, trong đó pha ở trên chứa DNA và RNA, đó mới là phần cần lấy. Lưu ý khi tách pha trên này, tuyệt đối không dụng đến phần interface (chỗ giao thoa của hai pha).

Cũng ước lượng thể tích V2 thu được, nếu cần thiết cho thêm nước vô để V2 bằng V1.

Bước 3-4 lặp lại nhiều lần cho đến khi ta không thấy phần interface nữa.

Kinh nghiệm của tôi là mỗi lần thu pha chứa DNA thường thể tích sẽ giảm đi một ích và do vậy DNA cũng mất đi 1 ít, do đó V1 thường nên cao cao một chút để DNA mất đi kô nhiều.

Sau khi thu dịch chứa DNA, thể tích cũng nên cân chỉnh lại cho bằng V1.




- B5: Lấy dịch trong, thêm 2ml RNase, ủ 37oC trong 1h (bước này hiện tại em chưa làm vì chưa có hóa chất).

RNAase nồng độ là bao nhiêu? Tui thường dùng RNAase có nồng độ gốc là 1000 mg/ml, khi đó RNAase nồng độ cuối cùng ?để ủ có nồng độ là 100mg/ml. Vậy phải biết nồng độ RNAase gốc và thể tích V1 là bao nhiêu để lấy lượng RNAase cho thích hợp.

===) Tui thường kô cần đến bước này, RNA thật sự kô ảnh hưởng phản ứng PCR của tôi.

Ngoài ra, để giúp việc loại bỏ tạp chất hiệu quả hơn thì có thể dùng hỗn hợp phenol:Chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1) trước (khoảng 2 lần) sau đó mới dùng Chloroform : isoamyl alcohol (khoảng 3 lần). Tuy nhiên do phenol là chất độc nên hiện nay người ta kô khuyến cáo dùng, nhưng nếu biết cách dùng thì rất hiệu quả, tui vẫn thường dùng phenol, kết quả loại tạp chất rất tốt. Nhưng để chuẩn bị phenol:Chloroform:isoamyl alcohol ?thì hơi cực vì phải cân chỉnh pH và có chất chống quang oxy hóa.



- B6: Thêm 250ml isopropanol lạnh, để tủa ở -20oC trong 30ph.

Thể tích isopropanol Vi cho vô sẽ là 2/3 so với V1. Nếu V1 là 1000 thì Vi là 600. Đây cũng là tỷ lệ quan trọng cần lưu ý.

Có thể để qua đêm mà kô sao cả.





- B7: Ly tâm 14000vòng, 5ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.

Đến đây thì tui thường rửa tủa DNA bằng cồn tuyệt đối 100% rồi  90% rồi  80%  rồi 70%. Chỉ việc cho cồn, lắc nhẹ, ly tâm rồi đổ dịch trong.

ủ 37oC cho cồn bay hơi hoàn toàn. Ủ chừng 30 phút là ok. Phải tuyệt đối sạch cồn, nếu không sẽ rất ảnh hưởng đến DNA tổng số.





- B8: Cho vào 300ml TE 1X, ủ 37oC trong 1h.

Ủ 1 tiếng chưa chắc DNA tan hoàn toàn, nếu DNA nhiều quá phải pipet nhẹ để cho DNA hoàn tan hoàn tan.

Đến đây đối với tôi là xong rồi kô cần làm thêm mấy bước dưới nữa.




- B9: Thêm 20ml Sodium acetate 3M + 640ml ethanol 100%, trộn đều, để ở -20oC trong 30ph.

Tui kô nhớ tỷ lệ (SA và EtOH) và dịch DNA là bao nhiêu, để tui coi lại.



- B10: Ly tâm 14000vòng, 10ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.

- B11: Rửa cặn với 400ml ethanol 70% bằng cách ly tâm 14000vòng, 2ph, 10oC. Đổ bỏ dịch trong.

- B12: Lập lại bước 11.

- B13: Để khô cặn, hòa tan cặn trong 70ml TE 1X, ủ 37oC trong 30ph.

- B14: Bảo quản mẫu ở -20oC.



Lưu ý là protocol gốc bao giờ người ta cũng ghi rõ tỷ lệ giũa các thể tích thành phần, để khi mình có hiệu chỉnh thì vẫn phải tuân theo tỷ lệ này. Protocol của bạn tui coi lướt qua hình như kô tuân theo tỷ lệ này.

GOOD LUCK

 

[Lâm Vỹ Nguyên]

Re: Tách DNA từ lá đước (rừng ngập mặn Cần G

cám ơn anh Dũng nhiều lắm! Hình như lần nào em có thắc mắc gì cũng điều được anh Dũng giúp đỡ đầu tiên hết ?
Em sẽ thực hiện lại quy trình theo những gì anh hướng dẫn. Hy vọng sẽ thành công tốt đẹp ?

Tại sao lại lấy dịch trong, viết chỗ này là kô rõ ràng. Khi CI và hỗn hợp dịch tế bào (đủ thú hằm bà lằng trong đó gồm cả DNA của bạn) phản ứng với nhau, dung dịch sẽ chia làm 2 pha, trong đó pha ở trên chứa DNA và RNA, đó mới là phần cần lấy. Lưu ý khi tách pha trên này, tuyệt đối không dụng đến phần interface (chỗ giao thoa của hai pha).

lấy dịch trong nghĩa là lấy pha ở phía trên. Tuy nhiên vì lá đước rất nhớt nên em nghĩ DNA có thể bị kéo xuống phía dưới và có thể nằm ở phần giao thao của 2 pha. Vì vậy em luôn cố gắng hút đến sát phần interface. Trong bước này thường sẽ hút lên thêm 1 ít cặn màu trắng đục. Không biết đây có phải là lý do em làm ko ra ko???
Em thu thập được 2 giống đước khác nhau : đước đôi Rhizophora apiculatta và đước râu (đây là cách gọi của người dân ở Cần Giờ, ko biết tên khoa học). Ở lá đước đôi khi qua hết b3 (ly tâm để lấy dịch nổi) thì có nhiều dịch nổi, còn lá đước râu thì lại rất ít dịch nổi (chỉ khoảng 1/3 so với đước đôi) mặc dù lượng mẫu và lượng hóa chất sử dụng là như nhau. Nếu trong dịch nổi chứa DNA thì em có thể hiểu là lượng DNA trong lá đước râu quá ít??? Điều này có đúng ko?
Em thấy lá đước có độ nhớt rất cao. Điều này có ảnh hưởng gì đến sự kết tủa DNA ko? Có thể DNA sẽ bị rửa trôi theo chất nhớt ko (ở b7)?? Khi em hạn đổ hết dịch trong, chấp nhận có nhiều tạp chất thì kết quả là có DNA

Lưu ý là protocol gốc bao giờ người ta cũng ghi rõ tỷ lệ giũa các thể tích thành phần, để khi mình có hiệu chỉnh thì vẫn phải tuân theo tỷ lệ này. Protocol của bạn tui coi lướt qua hình như kô tuân theo tỷ lệ này.

Vì em chỉ vừa tiến hành nên em chưa thể xây dựng được protocol cho riêng cây đước. Em sử dụng protocol của cây điều. Đây là protocol của những anh chị khóa trước và đã rất thành công.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Có loạt bài về Molecular Phylogeny of mangroves, nhưng tui chỉ lấy được 2 bài, hy vọng giúp ích cho bạn.

Đọc phần Tách DNA, cho thấy pp tách bằng CTAB của các tác giả là ok. Tuy nhiên có mấy điểm khác biệt.

01- Khi nghiền mẫu, họ nghiền trong Nitơ lỏng (bạn có biết tại sao kô?); tui kô dùng Nito lỏng vì mẫu vật của tui là Tảo đơn bào, do đó khi ly tâm lấy tb xong, tui thảy chúng vô tủ lạnh -80 độ rồi ngồi đọc báo từ 15-30 phút là đem ra làm tiếp.

02- Bạn vẫn chưa cho biết là Extraction Buffer của bạn có cái gì, lưu ý là người ta thường cho thêm beta-mercaptoethanol (từ 1-2%), chất này giúp làm bền DNA.

03- Ở bài số 1 bạn lưu ý người ta ghi rất rõ tỷ lệ thành phần; ví dụ lượng mẫu vật là 1 g thì thể tích CTAB buffer cho vô phải là 3 (xấp xỉ 3 ml); rời thể tích CI phải tương đương (tỷ lệ 1:1) so với dịch nổi chứa DNA; isopropanol tỷ lệ 2/3 ....

04- Tui nghĩ độ nhớt của lá đước có thể ảnh hưởng tptal DNA nhưng chắc kô có chuyện DNA bị kéo xuống phần giao thoa. Bạn thử nghĩ đến chuyện dùng phenol để loại tạp chất, chất nhớt... Nếu cần tui sẽ viết protocol chuẩn bị phenol như thế nào.

05- Bạn kô cần xây dựng quy trình tách DNA riêng cho cây đước mà cái cần lưu ý là tỷ lệ thể tích hóa chất thành phần. Bạn đọc protocol thấy bảo cho 250ml này, 100 ml kia, 35ml nọ nhưng điều cần hiểu là chúng phải tương quan tỷ lệ với khi đó nếu bạn có hiệu chỉnh (tăng hay giảm mẫu vật) thì lượng hóa chất cho vô cũng tăng giảm tương ứng.

 

[Trương Quốc Phong]

Một vài hints cho bạn:
Theo tôi, hiệu suất tách ADN của bạn chưa cao là do:
1. Mẫu của bạn bị "Nhớt": đây chính là vấn đề thường gặp phải khi tách ADN từ mẫu thực vật, nguyên nhân vì sao? "Nhớt" mà bạn gặp phải đó chính là Polysaccharide. Hàm luợng polysaccharide ở các loại thực vật khác nhau là khác nhau chính vì vậy mà có hiện tượng loài này thì tách ADN dễ, loài kia thì tách khó.
- Cách giải quyết vấn đề này như thế nào?
+ Bạn đã dùng đúng protocol để tách ADN có hàm lượng polysaccharide cao rồi đấy nhưng có điều là bạn có thể chưa hiểu tại sao người ta lại dùng như vậy nên bạn chưa khai thác được điểm mạnh của quy trình này thôi.
+ Ở protocol này người ta dùng CTAB chính là để khác phục "nhớt" của mẫu, CTAB có tác dụng như thế nào: vì bạn không nói rõ thành phần đệm của bạn nên tôi không thể đưa ra lời khuyên cụ thể mà chỉ giải thích như thế này:
CTAB có khả năng liên kết thuận nghịch với ADN và polysaccharide, cụ thể ở nồng độ muối cao (trên 1.4 M NaCl có trong đệm chiết) thì CTAB kết hợp với ADN và polysaccharide nhưng phức hợp CTAB-ADN tồn tại ở trạng thái hòa tan, trong khi đó phức CTAB-polysaccharide lại kết tủa, phức này sẽ được loại đi ở bước ly tâm đầu tiên.
Ở nồng độ muối dưới 0.7M thì phức CTAB-ADN lại kết tủa, cho phép bạn thu hồi lại ADN ở bước tủa cồn. Ở nồng độ muối thấp phức CTAB-ADN sẽ tách nhau ra. Phức này sẽ tách ra gần như hoàn toàn trong bước xử lý bằng RNase.
2. Khi tách mẫu thực vật cũng còn 1 yếu tố khác rất quan trọng đó là hợp chất polyphenol. Chất này có thể chuyển hóa thành quinon, mà quinon sẽ liên kết với ADN do vậy bạn rất dẽ làm mất ADN. Làm thế nào để khắc phục điều đó. Người ta thường bổ xung beta-mercaptoethanol, PVP để bất hoạt enzyme polyphenol oxidase, ngăn cản sự chuyển hóa polyphenol thành quinon.
Hy vọng bạn ứng dụng được vào đối tượng của mình.

 

[Lâm Vỹ Nguyên]

cám ơn anh Dũng và bạn truongquocphong nhiều. Sau 1 thời gian dài (gần 2tuần) bị thất bại liên tục ? ?Cuối cùng có lẽ tui đã tìm được lý do rồi. Tui đã lấy lộn ethanol 70% mà cứ tưởng là ethanol 100%. Ethanol 70% ko thể kết tủa hoàn toàn DNA nên từ bước 10 là tui đã đổ bỏ hết trơn DNA rồi. Ngày mai tui sẽ làm thử lại. Nếu ra band đẹp sẽ gởi lên để các bạn góp ý thêm ?

gởi anh Dũng : dung dịch EB của em gồm :
- 14ml NaCl 0.5M
- 0.5ml ?beta-mercaptoethanol 1%
- 2,5ml EDTA 0.5M
- 5ml Tris-HCl 1M
- 28ml nước
tổng thể tích 50ml

 

[Lâm Vỹ Nguyên]

Phù, cuối cùng cũng đã ly trích xong
Các bạn xem giùm tui mẫu DNA ly trích đã đủ tiêu chuẩn để chạy RAPD chưa? Tui ko sử dụng RNAse
Một số câu hỏi :
- Tại sao kích thước genome của các mẫu lại khác nhau (các band lệch nhau) ???. Đã chạy thử nhiềui lần nhưng vẫn ko thay đổi.
- Mẫu DNA cuối cùng rất nhớt (có thể hình dung như nước mũi ?vậy ) Việc lẫn nhiều tạp chất như vậy có ảnh hưởng gì đến phản ứng PCR ko? Có cách nào để loại bỏ tạp chất ko?
Xin cám ơn trước!!! ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Chất lượng DNA như vậy là chạy RAPD được rồi. Nhưng bạn nên pha loãng x5-10 mẫu 1,3 (trên) và ?mẫu 3 (dưới).

2. Nên xỷ lý RNase mẫu 2, 4,5 (dưới) đi để tránh ảnh hướng PCR. Bước 5: nên cho thẳng RNase vào trong EB ngay bước 1. (bảo quản EB tại 4oC)

3. Kích thước các băng sau khi tách DNA có thể cao thấp khác nhau do tính toàn vẹn của DNA genome khác nhau. Nói cách khác là do chất lượng DNA được tách ra khác nhau. Nhưng điều này không quan trọng lắm. Nói chung như thế này là OK vì ko bị smear dài, khủng khiếp

4. Mẫu bị nhớt có thể làm theo các phương án sau:
4.1. Biến tính 90oC trong 1h rồi RT 30 min => bỏ 1/10V NaOAC pH4,3 , tủa lại bằng Isopropanol rồi rửa EthOH 70%
4.2. Vontex mẫu trong phenol bão hòa Tris; chiết lại 1 lần trong 25:24:1 rồi lại 1 phát trong 24:1. Tủa lại DNA.
4.3. Nếu 2 cái trên mà vẫn ko giảm độ nhớt thì phải điều chỉnh nồng độ muối trong các buffer của pp tách chiết. Bạn cứ làm 2 phát trên trước xem thế nào đã nhé.

Chúc thành công.

 

[Lâm Vỹ Nguyên]

cám ơn anh (chú/bác) Hiếu nhiều!