Thành viên cũ
Senior Member
Chào các bác, các bác cho em hỏi chút về PCR. Theo các bác đâu là nguyên nhân chính của những lần chạy PCR âm tính? :?:
Kết quả PCR?
- Thread starter Thành viên cũ
- Start date
1. Nếu là chạy lần đầu tiên, phải xem mồi thế nào. Rất có thể thiết kê mồi không hợp lý.
2. Nếu cặp mồi đã được bảo đảm là hoạt động tốt nhưng mình chạy lại không lên, thử kiểm tra:
- Nhiệt độ gắn mồi (biết đâu lúc setup thí nghiệm không để ý)
- Tag polymerase (thử lấy tag đó chạy với một thí nghiệm khác xem có lên không). Thông thường tag cũng hay là một nguyên nhân ảnh hưởng đến PCR.
Tôi cũng chưa có nhiều kinh nghiệm chạy PCR thất bại nên chưa trả lời được nhiều hơn. Nói chung khi mồi đã ổn thì chạy cái nào cũng lên cả, những nguyên nhân khác ít khi gặp. Có một lần thất bại thì là do tag, thay tag khác thì chạy lên luôn. Còn những lần chạy không lên thì không thể nào lên nổi, lý do là mẫu đó ... thực sự âm tính
Bạn nào biết những nguyên nhân thường gặp nữa thì bổ xung nhé.
2. Nếu cặp mồi đã được bảo đảm là hoạt động tốt nhưng mình chạy lại không lên, thử kiểm tra:
- Nhiệt độ gắn mồi (biết đâu lúc setup thí nghiệm không để ý)
- Tag polymerase (thử lấy tag đó chạy với một thí nghiệm khác xem có lên không). Thông thường tag cũng hay là một nguyên nhân ảnh hưởng đến PCR.
Tôi cũng chưa có nhiều kinh nghiệm chạy PCR thất bại nên chưa trả lời được nhiều hơn. Nói chung khi mồi đã ổn thì chạy cái nào cũng lên cả, những nguyên nhân khác ít khi gặp. Có một lần thất bại thì là do tag, thay tag khác thì chạy lên luôn. Còn những lần chạy không lên thì không thể nào lên nổi, lý do là mẫu đó ... thực sự âm tính
Bạn nào biết những nguyên nhân thường gặp nữa thì bổ xung nhé.
Re: kết quả PCR?
Sorry dumas, bạn hỏi câu này thì chẳng ai trả lời được trừ khi thầy của bản, ngừơi hướng dẫn bạn làm việc biết hết mọi ngóc ngách việc bạn làm thì ok, ông/bà ta trả lời ngay. Chạy PCR để chẩn đóan khác để dò tìm lại khác; không có cái nào giống cái nào.
Tôi chạy cả ngàn PCR reations, nhưng hỏi tôi tại sao nó âm tính, tôi cũng chỉ lắc đầu vì tôi phải test lại từ water, buffer, dNTP, enzyme cho đến DNA template rồi đến PCR programme ... mới biết cái khúc mắc nằm chổ nào. Thậm chí tôi vứt công việc đó, đi phá làng phá xóm vài ngày về thì lại positive.
Dĩ nhiên là tôi có hàng tá kinh nghiệm của PCR nhưng chắc chắn tôi kô thể nói huyên thuyên kiểu shortgun tức là nới tào lao xịp bụp, trúng được chút nào hay chút đó. (sorry chữ shortgun này kô có ý nói đến bạn shortgun nhà ta nhé).
Bạn nên nói cụ thể việc bạn làm, tôi sẽ giúp bạn chẩn đóan bệnh PCR và gợi ý hướng khác phục.
dumas said:
Sorry dumas, bạn hỏi câu này thì chẳng ai trả lời được trừ khi thầy của bản, ngừơi hướng dẫn bạn làm việc biết hết mọi ngóc ngách việc bạn làm thì ok, ông/bà ta trả lời ngay. Chạy PCR để chẩn đóan khác để dò tìm lại khác; không có cái nào giống cái nào.
Tôi chạy cả ngàn PCR reations, nhưng hỏi tôi tại sao nó âm tính, tôi cũng chỉ lắc đầu vì tôi phải test lại từ water, buffer, dNTP, enzyme cho đến DNA template rồi đến PCR programme ... mới biết cái khúc mắc nằm chổ nào. Thậm chí tôi vứt công việc đó, đi phá làng phá xóm vài ngày về thì lại positive.
Dĩ nhiên là tôi có hàng tá kinh nghiệm của PCR nhưng chắc chắn tôi kô thể nói huyên thuyên kiểu shortgun tức là nới tào lao xịp bụp, trúng được chút nào hay chút đó. (sorry chữ shortgun này kô có ý nói đến bạn shortgun nhà ta nhé).
Bạn nên nói cụ thể việc bạn làm, tôi sẽ giúp bạn chẩn đóan bệnh PCR và gợi ý hướng khác phục.
Thành viên cũ
Senior Member
Re: kết quả PCR?
Cảm ơn bác!
=> Ý mình hỏi là trong cả ngàn lần chạy PCR của bác, chắc phải rút ra kinh nghiệm gì đó chứ , thì đâu là nguyên nhân chủ yếu.
=> Cụ thể là như thế nào hả bác, trình tự mồi ?, kích thước đoạn ?, thành phần phản ứng của những hãng nào ?, máy PRC ? Bác cần cụ thể đến mức nào đê em còn biết ?
Cảm ơn nhiều!
Cảm ơn bác!
=> Ý mình hỏi là trong cả ngàn lần chạy PCR của bác, chắc phải rút ra kinh nghiệm gì đó chứ , thì đâu là nguyên nhân chủ yếu.
=> Cụ thể là như thế nào hả bác, trình tự mồi ?, kích thước đoạn ?, thành phần phản ứng của những hãng nào ?, máy PRC ? Bác cần cụ thể đến mức nào đê em còn biết ?
Cảm ơn nhiều!
cơ bản là do DNA genome tức là khuôn bị degradated.
Nói như thế này là không chính xác. DNA genome với Khuôn (template) cho phản ứng PCR đâu có phải là 1. Ví dụ tách plasmid thì sao? Chỉ khi người ta tách DNA tổng số và dùng cái đó để làm template chạy PCR thì mới có thể nói như vậy.
dạ vì em chỉ chạy PCR trên DNA genome nên em nói thế; chứ mấy trường khác em ko biết ạ.
Thành viên cũ
Senior Member
the factor to consider when doing PCR
1- gene (DNA template quality and quantity, GC content of gene if the GC content is too high you should increase denature time or add DMSO, PEG, glycerol in to PCR reaction to reduce denature time)
2-DNA polymerase (taq, vent, Pfu, ... there are many kind of DNA polymerases, each kind has itselt convenience)
3-primer (Tm)
good luck,
1- gene (DNA template quality and quantity, GC content of gene if the GC content is too high you should increase denature time or add DMSO, PEG, glycerol in to PCR reaction to reduce denature time)
2-DNA polymerase (taq, vent, Pfu, ... there are many kind of DNA polymerases, each kind has itselt convenience)
3-primer (Tm)
good luck,
Đây là do sv_nghèo hỏi nhầm ng thôi. Đừng vơ đũa thế.
Kinh nghiệm của lonxon là đáng trân trọng. Nói chung PCR negative thì đơn giản là 1 khâu nào đó err -> check hết thành phần PCR cộng với máy PCR, chu trình nhiệt thực, block, eff, mineral oil ...
Riêng cái đi chơi rồi sau làm lại thì tôi rất phục ông lonxon :!: vì tôi cũng làm thía
Đây là nguyên lý chung của tất cả các thí nghiệm khoa học chứ chẳng phải riêng PCR.
@ dontcry: template nói chung thôi cần gì phân biệt rõ là genome, plasmid, cDNA .. làm gì. Cái gì mà chẳng có thể bị degradation.
Kinh nghiệm của lonxon là đáng trân trọng. Nói chung PCR negative thì đơn giản là 1 khâu nào đó err -> check hết thành phần PCR cộng với máy PCR, chu trình nhiệt thực, block, eff, mineral oil ...
Riêng cái đi chơi rồi sau làm lại thì tôi rất phục ông lonxon :!: vì tôi cũng làm thía
Đây là nguyên lý chung của tất cả các thí nghiệm khoa học chứ chẳng phải riêng PCR.
@ dontcry: template nói chung thôi cần gì phân biệt rõ là genome, plasmid, cDNA .. làm gì. Cái gì mà chẳng có thể bị degradation.
Cần phải phân biệt chứ.
Chạy PCR từ DNA klhuôn là plasmid với chạy từ khuôn là một đoạn DNA kích thước ngắn rõ ràng là khác nhau. Hôm nọ tôi có chạy 1 phản ứng PCR thất bại vì không đặt nhiệt độ biến tính phù hợp. Tôi chạy từ plasmid nhưng để nhiệt độ biến tính có 50 giây ở 94 độ C. Sau đó chỉnh lại, tăng thời gian biến tính lên 1 phút thì OK. Nhưng khi chạy PCR từ một đoạn DNA ngắn khác thì 50 giây là đủ.
Một kinh nghiệm nữa là phải quan tâm đến độ dài đoạn cần khuếch đại. Tôi cũng đã kiểm tra thử 1 lần bằng cách chạy 2 phản ứng PCR của cùng 1 mẫu, mọi thứ giống nhau, chỉ khác là thời gian kéo dài khác nhau. Kết quả là một mẫu lên còn mẫu kia thì không.
Một kinh nghiệm thuộc loại xương máu của ông anh cùng phòng tôi khi chạy PCR H5N1. Chạy xong ra đúng 1 băng với kích thước đúng như tính toán. Yên chí lớn vác sang phòng bác vietbio để giải trình tự. Giải trình tự xong được một đoạn lạ hoắc. Truy trên mạng thì hóa ra đây là đoạn của người. => Bài học rút ra là mồi PCR đôi khi chỉ cần bám tốt ở một số nucleotide đầu 3' là đã đủ để thực hiện nhiệm vụ. Do đó, khi mà bạn chưa giải trình tự thì mọi cái chỉ là "có thể"
Nhắc lại 1 câu nói: Chân lý khoa học xuất phát từ phòng thí nghiệm.
Re: NON
Hay đấy, cậu có thể kể vài kinh nghiệm contamination của cậu được ko? Hi hi, ko biêt Pháp y quân đội mà nhầm thì chậc chậc .. ko dám nghĩ đến tai họa kinh khủng thía nào
. (có quen nhau ko nhỉ?)
to dontcry: bàn tiếp nhé (may có bài mới nên anh mới để ý đến topic này)
Cái này là ko chắc đâu nhé. vì em chạy từ DNA genome theo lý thuyết thì kích thước của nó phải lớn gấp nhiều nhiều lần so với cái plasmid cỏn con. (nhất là phòng sếp Kháng làm về người ). Thía cho nên trường hợp này anh nghĩ là do nồng độ template khác nhau nên em mới có kết quả như trên.
vatuan13 said:Này cậu bạn ! Với PCR thì tất cả các yếu tố đều có thể làm thay đổi kết quả của phản ứng, từ nhiệt độ đến mẫu, thậm chí khi thay bất cứ một loại hóa chất nào của phản ứng cậu đều phải thử lại điều kiện chuẩn của nó.
Còn nếu bàn về cái chuyện contamination trong sequencing, thì tớ đây có cả một kho chuyện tương tự như thế. Chỉ cần thiếu cẩn thận một chút là cậu có thể nhầm ngay, tôi đã nhiều lần phải đọc đi đọc lại cái kết quả sequence của chính mình rồi đấy. !!!
Hay đấy, cậu có thể kể vài kinh nghiệm contamination của cậu được ko? Hi hi, ko biêt Pháp y quân đội mà nhầm thì chậc chậc .. ko dám nghĩ đến tai họa kinh khủng thía nào
. (có quen nhau ko nhỉ?)to dontcry: bàn tiếp nhé (may có bài mới nên anh mới để ý đến topic này)
Cái này là ko chắc đâu nhé. vì em chạy từ DNA genome theo lý thuyết thì kích thước của nó phải lớn gấp nhiều nhiều lần so với cái plasmid cỏn con. (nhất là phòng sếp Kháng làm về người
). Thía cho nên trường hợp này anh nghĩ là do nồng độ template khác nhau nên em mới có kết quả như trên.Đơn giản thôi, chạy lại vài lần nữa rồi mới phát biểu ý kiến được
PCR mà bác cứ làm như nấu nồi cơm vậy, nay nát mai bớt nước được ngay ý . Cả chục điều kiện có thể hỏng, lỗi, biết sao được mà bác hỏi vu vơ. Mà bác độn nhiều tiếng Anh quá!
Tiện đây cho em hỏi mọi người cái, các đoạn oligo (temp DNA, primer..) các hòn gạch (dNTP) nếu cứ pha trong dung môi dI H2O thì nó sẽ bị out mất một loại nu, cái này đúng không nhỉ ??? nên dùng TE đúng không ạ ?
Mà trứơc khi setupPCR, có nên làm tan hoàn toàn các thành phần không, hay là nên để tan một phần thôi !!
Hỏi thêm thế để các em khác lắng nghe các bác nói chiện, còn em sẽ góp ý hôm sau, vui chiện cùng các bác nhé !
PCR mà bác cứ làm như nấu nồi cơm vậy, nay nát mai bớt nước được ngay ý . Cả chục điều kiện có thể hỏng, lỗi, biết sao được mà bác hỏi vu vơ. Mà bác độn nhiều tiếng Anh quá!
Tiện đây cho em hỏi mọi người cái, các đoạn oligo (temp DNA, primer..) các hòn gạch (dNTP) nếu cứ pha trong dung môi dI H2O thì nó sẽ bị out mất một loại nu, cái này đúng không nhỉ ??? nên dùng TE đúng không ạ ?
Mà trứơc khi setupPCR, có nên làm tan hoàn toàn các thành phần không, hay là nên để tan một phần thôi !!
Hỏi thêm thế để các em khác lắng nghe các bác nói chiện, còn em sẽ góp ý hôm sau, vui chiện cùng các bác nhé !
sorry toi ko go VNese duoc vi dang xai may Mac, chiu kho doc gium nghen.
Toi chay PCR nhu com bua, nhung hoi tui thong so cua cai PCR dang chay la bao nhieu, tui cuoi khi khi de tui mo may ra coi, boss tui cung the, dieu quan trong la co hang chuc cai programes trong PCR machine ta fai biet chon cai nao cho chinh xac.
Boss tui cung vay.
Cai dau con nguoi ta tuy co den 12-14 ty tb than kinh nhung xai chang bao nhieu. Tuoi nho thi nho may cai vat vanh, ma manh de di hu doa thien ha rang ta biet nhieu. Chu khi lon hon 1 chut, dieu quan trong la phai biet gom nhung dieu ma manh vat vanh do thanh 1 cai HE THONG de ma di GIAI THICH hay dung hon la DAY lai nguoi ta, do moi la cai dau cua 1 khoa hoc gia that su.
Cai dau cua tui chang bao gio nho noi cai gi minh da doc hay hoc, nhung tui biet cach tra cuu lai nhung gi minh da biet hay da hoc de ... tao lao xit bup voi thien ha.
Xa gi cai Tm hay PCR programe, tui tin la ai do da chay PCR han nhien phai nam vung ve DNA, the ma tui tin la tui hoi vai cau DNA chac chan vai anh chi se cuoi khi khi hoac tra loi trot quot.
Thoi, tao lao vay du roi.
Toi chay PCR nhu com bua, nhung hoi tui thong so cua cai PCR dang chay la bao nhieu, tui cuoi khi khi de tui mo may ra coi, boss tui cung the, dieu quan trong la co hang chuc cai programes trong PCR machine ta fai biet chon cai nao cho chinh xac.
Boss tui cung vay.
Cai dau con nguoi ta tuy co den 12-14 ty tb than kinh nhung xai chang bao nhieu. Tuoi nho thi nho may cai vat vanh, ma manh de di hu doa thien ha rang ta biet nhieu. Chu khi lon hon 1 chut, dieu quan trong la phai biet gom nhung dieu ma manh vat vanh do thanh 1 cai HE THONG de ma di GIAI THICH hay dung hon la DAY lai nguoi ta, do moi la cai dau cua 1 khoa hoc gia that su.
Cai dau cua tui chang bao gio nho noi cai gi minh da doc hay hoc, nhung tui biet cach tra cuu lai nhung gi minh da biet hay da hoc de ... tao lao xit bup voi thien ha.
Xa gi cai Tm hay PCR programe, tui tin la ai do da chay PCR han nhien phai nam vung ve DNA, the ma tui tin la tui hoi vai cau DNA chac chan vai anh chi se cuoi khi khi hoac tra loi trot quot.
Thoi, tao lao vay du roi.
Chạy lại phát nữa, nhỡ đâu lên
Chạy lại vẫn thế thì kiểm tra primer trên lý thuyết cái, xem có đúng là nó không. Sau đó xem nhiệt độ gắn mồi. Nếu nhiệt độ 2 mồi khác nhau thì lấy nhiệt độ gắn mồi của mồi thấp hơn. Trong trường hợp treo đầu RE thì hạ xuống 1 độ nữa.
Đấy, nếu là tớ thì sẽ làm như vậy. Đúng hết rùi mà vẫn không lên thì vào trang botay.net tìm cao thủ mà hỏi
dontcry said:Chạy lại phát nữa, nhỡ đâu lên
Chạy lại vẫn thế thì kiểm tra primer trên lý thuyết cái, xem có đúng là nó không. Sau đó xem nhiệt độ gắn mồi. Nếu nhiệt độ 2 mồi khác nhau thì lấy nhiệt độ gắn mồi của mồi thấp hơn. Trong trường hợp treo đầu RE thì hạ xuống 1 độ nữa.
Đấy, nếu là tớ thì sẽ làm như vậy. Đúng hết rùi mà vẫn không lên thì vào trang botay.net tìm cao thủ mà hỏi
...hi'hi', nó lên rồi ấy ạ... và may qua', tớ cũng kịp tìm hiểu xem tại sao lần trước lại ko được rồi...
hihidontcry said:Chạy lại phát nữa, nhỡ đâu lên
Chạy lại vẫn thế thì kiểm tra primer trên lý thuyết cái, xem có đúng là nó không. Sau đó xem nhiệt độ gắn mồi. Nếu nhiệt độ 2 mồi khác nhau thì lấy nhiệt độ gắn mồi của mồi thấp hơn. Trong trường hợp treo đầu RE thì hạ xuống 1 độ nữa.
Đấy, nếu là tớ thì sẽ làm như vậy. Đúng hết rùi mà vẫn không lên thì vào trang botay.net tìm cao thủ mà hỏi
...hi'hi', nó lên rồi ấy ạ... và may qua', tớ cũng kịp tìm hiểu xem tại sao lần trước lại ko được rồi...
hihiRuanhocon đã làm thành công rồi sao không cho mọi người biết lí do tại sao mà lần trước bạn không làm thành công còn bây giờ bạn đã làm được để mọi người học hỏi với?
Sẳn đây cho tôi hỏi các bác hiểu nhiều về PCR một câu hỏi như sau: các bác giải thích cơ chế hoặt động của primer và Tag với ?
Thanks các bác nhiều nhé!
Sẳn đây cho tôi hỏi các bác hiểu nhiều về PCR một câu hỏi như sau: các bác giải thích cơ chế hoặt động của primer và Tag với ?
Thanks các bác nhiều nhé!
Tôi chẳng hiểu nhiều về PCR chỉ biết người ta bảo bọn primer nó cứ chạy lung tung trên cái mạch khuôn, khi đến chỗ phù hợp thì nó gắn vào, không phù hợp thì nó lại chạy đi.
Còn muốn hiểu cơ chế của Tag thì phải biết cấu trúc của nó, nếu bạn biết cấu trúc rồi thì nói chuyện tiếp.
Similar threads
