Tách DNA từ lá điều để chạy RADP

[Thành viên cũ]

Các bạn ơi, mình đang làm đồ án tốt nghiệp , đề tài là tìm hiểu tính đa dạng di truyền của cây điều, cơ chế dựa trên phương pháp RADP (AFLP (and RFLP) of cashew) , nhưng mà mình gặp 1 vướng mắc gỡ mãi ko ra. Số là mình ko làm sao để trích lý DNA cho đạt chuẩn được. Theo lý thuyết thì kết quả trích lý bằng lá non là kết quả tốt nhất, nhưng ở lá điều non thì mình lại ko trích lý được DNA mà không tìm ra được nguyên nhân. Mình có thế trích lý được trên lá trưởng thành nhưng bị mear lắm, y như đuôi sao chổi. Thông thường , DNA đạt chât lượng khi chụp máy và nhuộm tia UV phải ra 1 band thật sáng (và chỉ một band đó thôi). Nhưng của mình đều ra 1 vết dài hoặc 1 band có một vệt dài bên dưới, người ta gọi đó là gãy DNA. Mình ko biết ngoài nguyên nhân đó còn có nguyên nhân nào khác không. Mình muốn tìm ra nguyên nhân và cách khắc phục. ít nhât làm ko ra thì phải tìm được nguyên nhân thất bại mới báo cáo được. Mình còn thời gian ít lắm...huhuhu...Ai giúp mình với. Còn một chi tiết nữa, lá điều mình phải về Nha Trang lấy , trữ vài ngày rồi mới đưa vào phòng thí nghiệm. Ko biết có phải đây là nguyên nhân ko nữa.
Bây giờ mình rất cần tài liệu về
1. Thành phần hóa học của lá cây me, cây cacao.
2. Phương pháp trích lý DNA của cây điều (nhất là quy trình (protocol)).
Có bạn nào có thì giúp mình với nhen....huhuhuhu.....

 

[Lê Tiến Dũng]

Chào bạn Gianghanviet,

Mình chưa tách DNA từ thực vật nên ko thể chỉ bạn protocol nhưng có vài ý thế này:

1- Cái smear dài dài đó có thể là RNA bạn đã xử lý với RNAase chưa? nếu chưa thì xử lý với RNAase xem nó có hết không.
2- Khi lấy mẫu ở xa bạn có thể đem theo 1 bình nitơ lỏng nhỏ để bảo quản mẫu trước khi đem về phòng thí nghiệm, nơi có điều kiện bảo quản lạnh sâu.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tôi tách DNA từ thực vật khá nhiều rồi. Trước tiên bạn tách bằng pp CTAB hay dùng Protease K? Nêu vắn tắt protocol và upload cái ảnh điện di lên được ko?

 

[Nguyễn Đặng Thu Cúc]

Các bạn ơi, mình đang làm đồ án tốt nghiệp , đề tài là tìm hiểu tính đa dạng di truyền của cây điều, cơ chế dựa trên phương pháp RADP (AFLP (and RFLP) of cashew) , nhưng mà mình gặp 1 vướng mắc gỡ mãi ko ra. Số là mình ko làm sao để trích lý DNA cho đạt chuẩn được. Theo lý thuyết thì kết quả trích lý bằng lá non là kết quả tốt nhất, nhưng ở lá điều non thì mình lại ko trích lý được DNA mà không tìm ra được nguyên nhân. Mình có thế trích lý được trên lá trưởng thành nhưng bị mear lắm, y như đuôi sao chổi. Thông thường , DNA đạt chât lượng khi chụp máy và nhuộm tia UV phải ra 1 band thật sáng (và chỉ một band đó thôi). Nhưng của mình đều ra 1 vết dài hoặc 1 band có một vệt dài bên dưới, người ta gọi đó là gãy DNA. Mình ko biết ngoài nguyên nhân đó còn có nguyên nhân nào khác không. Mình muốn tìm ra nguyên nhân và cách khắc phục. ít nhât làm ko ra thì phải tìm được nguyên nhân thất bại mới báo cáo được. Mình còn thời gian ít lắm...huhuhu...Ai giúp mình với. Còn một chi tiết nữa, lá điều mình phải về Nha Trang lấy , trữ vài ngày rồi mới đưa vào phòng thí nghiệm. Ko biết có phải đây là nguyên nhân ko nữa.
Bây giờ mình rất cần tài liệu về
1. Thành phần hóa học của lá cây me, cây cacao.
2. Phương pháp trích lý DNA của cây điều (nhất là quy trình (protocol)).
Có bạn nào có thì giúp mình với nhen....huhuhuhu.....

Thời gian vừa rồi em có làm tách DNA từ lá cây thực vật (Arabidopsis Thaliana), em cũng có DNA isolation protocol (với CTAB). Nếu chị cần em có thể post lên đây để chị tham khảo.
Em cũng gặp trường hợp tương tự là DNA thu được không tốt lắm. Em nghĩ nguyên nhân chính là do quá trình tách, và preserve lá cây sau khi lấy mẫu.
Smear chị nhìn thấy rất có thể là RNA, có thể loại bỏ bằng cách dùng RNase. Nhưng em nghĩ hai phương pháp AFLP và RFLP chỉ work on DNA, nên RNA không interfere nhiều đâu ạ. Nên RNase có lẽ không cần thiết.

 

[Thành viên cũ]

Protocol và mẫu kết quả của lá điều

PROTOCOL
- B1: nghiền mẫu lá tươi bằng cối trong 1.2ml EB buffer
(EB: tris-HCl, NaCl, EDTA, CTAB, nước cất)
-B2: cho vô eppendorf 1.5ml, vortex ky (khoang 5 - 10 phut)
-B3:ủ ở 65 độ C trong 45 phút
-B4: cho chloroform/isoamyl (24:1) vào, vortex (10 phut), ly tâm 5 phút
14.000vònng 10độ C
-B5: hút dịch noi cho vô eppendorf mới, lập lại B4
-B6: cho RNase ủ 37 độ C trong 60 phut
-B7: cho isopropanol để -20 độ C trong 30 phút (nhưng thường cho qua đêm vì qui trình quá dài )
-B8: ly tâm 14.000 vòng trong 5 phut 10 độ C
-B9: do dich tren, lấy kết tủa.
-B10: cho TE 1X u 37doC 30phut  để tan kết tủa rồi thấm sodium acetat
va ethanol 100% vao ly tâm14.000 vòng 5 phút 10 độ C
-B11: rửa bằng ethanol 70% 2 lần bằng cách do dd vao ket tua roi ly
tam 14.000vong 2phut 10doC.
-B12: để khô tự nhiên rồi  cho TE 1X u 37doC trong 30 - 60phut.
ton tru -20doC
                                                    END.
CÂU HỎI :
-đã cho RNase nên những vết smear đó không phải là  RNA với lại nếu là
RNA thi smear sẽ nằm rất thấp, dưới cả vệt  loading dye cuối cùng (đã thử ko cho RNase).
Vậy liệu ngoài khả năng là DNA gãy thì smear đó có thể là gì khác không?
-Ðã thực hiện các thao tác rất nhẹ nhàng, làm trên cây me và ca cao cùng 1 quy trình như vậy nhưng band rất to, ko có hay rất ít smear.
-Liệu việc lưu trữ khá lâu mẫu trong tủ lạnh trước khi đưa vào tủ  -20 độ C và thời gian tồn trữ khá lâu trong quá trình trích lý (khoảng trên dưới 2 tuần mỗi lần tồn) có ảnh hưởng ko?
-Ngòai cách nghiền mẫu lá tươi có cách lý trích nào khác , để có thời gian thu thập và lưu tồn mẫu được lâu hơn (vì làm về đa dạng di truyền) ở đây có làm thử bằng mẫu lá khô (làm khô bằng  silicagel) nhưng trích lý ra rất smear.
-Vì sao lá điều non lý trích ko ra ?

 

[Trần Hoàng Dũng]

bạn cho RNAse tỷ lệ bao nhiêu % vậy?

rất có khả năng smear của bạn là RNA và còn dính thêm 1 số protein khác nên nó chạy chậm vì thế vệt smear này nằm thấp.

Trong protocol bạn làm có 2 điểm tui chú ý:
-B4: cho chloroform/isoamyl (24:1) vào, vortex (10 phut), ly tâm 5 phút
14.000vònng 10độ C
-B5: hút dịch noi cho vô eppendorf mới, lập lại B4
-B6: cho RNase ủ 37 độ C trong 60 phut

Trước khi sang bước 6, bao giờ tui cũng lọc lấy tủa DNA bằng Et 80%, lọc rữa kỹ lưỡng, để khô tự nhiên vài tiếng, xong mới cho TE buffer vào hòa tan DNA kế đến mới cho RNAase vô. Vì quá trình bạn thu dịch nổi ở bước 5 có thể dính 1 chút xíu Chloroform gây ảnh hưởng đến RNAase. Trong khi ủ với RNAase ?phải lắc nhẹ cho RNAse hòa tan đều.

Tôi sẽ chuyển câu hỏi của bạn cho 1 chuyên gia làm về thực vật giúp giải đáp.

 

[Luyện Quốc Hải]

HI.
Mình xem quy trình của bạn rùi. Mình có một số góp ý sau.
- Nếu chât lượng ADN như trong ảnh bạn post lên thì QUÁ đủ đề làm RAPD, mình cũng làm rât nhiều về RAPD, ADN như bạn tách được là quá tốt để bạn làm RAPD, hãy yên tâm về chât lượng ADN.
- Nếu bạn còn muốn tối ưu hơn thì mình có một số góp ý sau:
?+ Trong quy trình của bạn, ở bước 4, không nên voltex đến 10 phút, mà chỉ nên lắc mạnh bằng tay 6-7 lân. Đây cũng là một trong những nguyên nhân gây gãy ADN.
+ Kiểm tra lại ARNse, bạn nên chắc chắn rằng ARNase đã được loại bỏ ADNase bằng cách đun ởn 100oC trong 10 phút (có thể dùng máy PCR).
+ Việc tách ADN từ mâũ lá non thì theo tôi, bạn phải nghiền nhẹ tay hơn vì thành tế bào ở mâũ lá non không chắc như ở lá già, do đó có thể bạn đã làm gãy cơ học ADN ở giai đoạn nghiền mâũ. Bạn có thể nghiền mâũ lá non bằng ống Effendorf 1.5ml, "chày" thì bạn dùng đâù tip 1ml hơ nóng rùi ấn nhanh vào ống Eff 1.5ml xoay để tạo đâù tròn của ống và vừa khít với CỐI. Nghiền bằng dụng cụ này sẽ có lực nghiền yếu hơn.
+ Còn một góp ý nữa. Sau bước 3. Bạn nên cho mâũ vào thùng đá và lắc nhẹ 50-100 vòng/phút trong 1,5h. Bước này sẽ giúp ADN được chiết ra tốt hơn..
? Tui chỉ giup được vâỵ thôi, hy vọng là bạn sẽ thành công.
Chú ý là: nếu không có thời gian nhiều thì ADN mà bạn tách được vân là quá tốt đề làm RAPD (nhớ phải đo OD, đưa về nồng độ tối ưu 100ng ADN/1ul để RAPD được chạy tốt).
BYE

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tôi đồng ý với skyvn về cái hình ảnh. Chất lượng DNA bạn tách như thế đã được rồi. Bạn chỉ cần đo OD thêm để khẳng định tính sạch của sản phẩm DNA.

Tôi không nghĩ những vệt mờ đấy là do RNAase đâu. Bóng rRNA đã loại hết rồi thì không có lý do gì bảo RNAase ko hoạt động.

Đối với các mẫu đã tách rồi, bạn muốn đẹp hơn thì chỉ việc "tủa lại bằng EtOH", điện di lượng mẫu đậm hơn, chỉnh ống kính, bấm máy remove background.

Đối với mẫu chưa tách, có 2 cách tối ưu

1. nếu bắt buộc phải tủa qua đêm thì bạn thử thay isopropanol bằng EtOH 100% chưa?

2. giảm thời gian ử mẫu ở 65oC xuống 30 min.

Đối với mẫu lá non, tôi không cho rằng DNA bị vỡ khi bị nghiền cơ học. Ở bên này khi tôi đến thăm phòng thí nghiệm chuyên tách DNA bằng CTAB. Họ nghiền mẫu bằng robot sử dụng lực từ để "lắc" viên bi sắt trong khi mẫu đựng trong đầu tip 1 ml. Do đó, khi thu mẫu họ thu thẳng vào hộp đầu tip, nhúng ngay vào nitơ lỏng (đây là bắt buộc, và cũng có thể là lý do bạn mất mẫu khi tách mô lá non, tế bào non chứa nhiều nuclease), bổ sung đệm vào đầu tip và đưa lên máy. Quy trình này rất công nghiệp .

Tôi sẽ nhờ 1 bạn chuyên trách quy trình này để hỏi xem họ có thay đổi gì trong buffer so với của bạn ko?

 

[Thành viên cũ]

Mình rất cảm ơn sự đóng góp nhiệt tình của các bạn, nó giúp minh tự tin hơn rất nhiều, thật sự giờ mình rối quá!!!
?mình muốn hỏi không biết có tài liệu nào đó noi về cái smear này không? liệu nó có ảnh hưởng gì đến việc chạy RAPD không, vì RAPD la dùng các cặp mồi ngẫu nhiên dể nhân các đọan fragment rồi so sánh số đoạn nay để xác định tính đa dạng di truyền. nhưng nếu DNA bị gãy như vậy thì sẽ tạo ra những đoạn fragment ngắn, bị cắt ngang do bị gãy, vậy có ảnh hưởng đến kết quả phân tích tính đa dạng không? không biết có sách vở nào đó nói về vấn đề này không, vì lên báo cáo mình cần có "sách , có chứng" cho các thầy về khả năng vẫn có thể dung RAPD của mẫu ly trích này là đảm bảo. các bạn có thể giúp mình với, có thể giải đáp dùm mình không?

 

[Trương Quốc Phong]

Theo quan điểm của mình về hình ảnh mà bạn post lên, mình có một số nhận xét như sau:
1. Về hàm lượng DNA, như vậy là đã đủ để làm phản ứng PCR-RAPD, vì kỹ thuật này chỉ cần một luợng nhỏ ADN (khoảng vài đến vài trục ng là đủ). Dùng nhiều quá cũng không tốt.
2. Về chất lượng, như vậy chưa thể nói là được hay không. Vì sao? nếu bạn dùng ngay mẫu này để chạy RAPD thì tôi nói là hoàn toàn chưa đựợc. Vì sao? Vì chất lựợng ADN ở các mẫu không như nhau, vệt smear quá đậm. Mặc dù bạn vẫn thu được kết quả PCR-RAPD sau khi điện di, có thể là còn đẹp nữa. Nhưng bạn đã bị mắc vào 1 trong 5-6 disadvantages của PCR-RAPD đó là cần phải có DNA tổng số đồng đều về chất lựơng giữa các mẫu, ADN phải tương đối nguyên vẹn thì khi đó ta mới so sánh đựợc trên nguyên tắc của phương pháp PCR-RAPD. Điều này đặc biệt lưu ý khi làm với RAPD. (ngoài tài liệu tôi tham khảo khi làm việc với RAPD, GS Lê Trần Bình cũng đã nói với chúng tôi về vấn đề này).

Xem quy trình của bạn tôi có một vài góp ý:
1. Bạn đã sử dụng CTAB để tách ADN, detergent này rất thích hợp cho việc loại bỏ protein và đặc biệt là polysaccharide (polysacchride se làm cho dịch chiết ADN trở nên bị nhớt). Do vậy, CTAB rất được ưa dùng trong việc tách ADN thực vật và các mẫu có chứa hàm lượng polysaccharide cao.
Nhưng bạn cần phải sử dụng đúng cách thì CTAB mới phát huy đựợc tác dụng của nó. Trong quy trình bạn đưa ra bạn không nói Nồng độ của Nacl, và nồng độ của CTAB là bao nhiêu. Điều này cực kỳ quan trọng. Bạn cho tôi biết bạn đã dùng nó bao nhiêu khi đó tôi sẽ gợi ý cho bạn.
2. Bạn dùng Isopropanol để kết tủa ADN, nhưng bạn lại thực hiện ở -20oC. Ở điều kiện này nhiều protein và các chất khác cũng bị kết tủa cùng ADN nên trong mẫu của bạn se bị lẫn tạp. Người ta thường thực hiện ở RT để tránh protein kết tủa cùng (điều này được chú ý khi dùng Isopropanol). Tôi đã thử và quả đúng như vậy.
3. Vì mẫu của bạn là Thực vật, nhưng tôi không thấy bạn dùng chất nào để can thiệp vào các hợp chất polyphenol, sắc tố,... chất này có thể chiếm tới 30% trong thực vật. Vì sản phẩm biến đổi của polyphenol sẽ liên kết vào ADN tạo thành phức và đi vào cùng với ADN khi bạn kết tủa. Hơn nữa, nó có thể ảnh hưởng đến enzym polymerase vì nó bắt mất ion Mg.

Đấy là một vài gợi ý nho nhỏ của tôi, bạn tìm hiểu xem thế nào nhé.
Chúc bạn thành công.

 

[leduchuankhtn]

Gửi bạn thành viên cũ!

Bạn ơi cho mình hỏi [FONT=&quot](EB: tris-HCl, NaCl, EDTA, CTAB, nước cất) tỉ lệ như thế nào vậy nhỉ?
[/FONT]