Realtime PCR: Hỏi đáp

[Dương Văn Cường]

Vận động bà con trao đổi về đề tài của mọi người mà chưa thấy ai hưởng ứng, đành đi tiên phong vậy, cho dù đề tài của tôi còn chưa được tiến hành.

Tôi sẽ làm một đề tài, trong đó có sử dụng Realtime PCR để làm công cụ nghiên cứu.

Tôi định viết một bài giới thiệu về phương pháp PCR mới mẻ này tới những bạn chưa biết về Realtime nhưng chưa có thời gian (đúng hơn là đầu óc lúc này chưa tập trung được), đành mở tạm topic này để cùng thảo luận với những bạn đã biết về món này. Việc viết một số bài giới thiệu nguyên lý Realtime tôi sẽ thực hiện vào một ngày gần đây.

Mong rằng topic này sẽ là một topic hay của forum chúng ta.

Now, please ...

 

[sv_ngheo]

Tôi muốn hỏi một câu thôi, bạn giúp tôi với nhé:

Threshold cycle cho ta biết điều gì vậy ?

Mình bắt đầu hỏi, mong bạn trả lời !

 

[Dương Văn Cường]

Threshold cycle (Ct) là một yếu tố quan trọng trong Real Time PCR. Định nghĩa của Ct là số chu kỳ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang bắt đầu vượt qua (cross) giá trị threshold.

Vậy, cần hiểu threshold là cái gì

Real Time PCR được dùng để định lượng với 1 độ chính xác cực kỳ cao. Do đó, việc đo tín hiệu huỳnh quang (là giá trị đại diện của nồng độ DNA mạch kép trong phản ứng) phải được tiến hành thật chuẩn.

Để làm được điều này cần thiết phải có một hệ đệm được thiết kế để ổn định các điều kiện. Trong hệ đệm này (do nhà sản xuất cung cấp) có một chất làm đối chứng (Passive reference). Khi đo tín hiệu huỳnh quang của reporter, máy sẽ dựa trên tín hiệu của Passive reference. Giá trị thương số khi lấy Cường độ tín hiệu huỳnh quang reporter chia cho cường độ tín hiệu huỳnh quang Passive reference được ký hiệu là Rn.

Threshold được định nghĩa là độ lêch chuẩn trung bình của giá trị Rn trong các chu kỳ đầu của PCR.

Để hiểu đúng hoàn toàn cách tính toán, cách xử lý ... của Real time là rất khó. Nên hiểu theo quan điểm của nhà sinh học, với tư cách người sử dụng công nghệ.

Ý nghĩa của Threshold và Threshold cycle:

- Threshold là điểm bắt đầu của sự phát hiện tín hiệu huỳnh quang.
- Ổn định: Trong các chu kỳ đầu của phản ứng PCR, cường độ tín hiệu huỳnh quang thay đổi lên xuống thực chất chỉ là "nhiễu". Threshold cycle và Baseline phải được đặt sao cho máy Real Time "không thèm chấp" các tín hiệu nhiễu này.
- Xác định giá trị Ct sao cho đúng đồng nghĩa với việc tìm được điều kiện phù hợp nhất, đúng đắn nhất để đo cường độ huỳnh quang.

 

[Homosapiens]

Nghe người ta nói real time PCR sử dụng SYBR Green I có độ nhạy cao hơn real time PCR sử dụng Taqman probe, molecular beacons... điều này có đúng không ? (theo mình nghĩ về lý thuyết có thể đúng nhưng không biết thực nghiệm ntn, các bạn có ai đã so sánh thử chưa).
À, tại sao mình không thay EtBr bằng SYBR Green khi nhuộm DNA nhỉ, mình thấy có người đã làm rồi mà.

 

[Dương Văn Cường]

Chào Homosapiens

So sánh như vậy khập khiễng quá vì mục tiêu của 2 assay này khác nhau.

Tagman Probe (Hydrolysis Probe) ứng dụng chủ yếu để xác định đột biến: SNP, Allelic Discrimination

SYBR Green I ứng dụng để làm định lượng. Có thể tính ra đến số lượng bản copy của template nếu có mẫu làm đường chuẩn.

Về độ nhạy của SYBR Green I thì khỏi nói. Cực kỳ chính xác. Nếu bạn làm thí nghiệm mà thấy củ chuối thì đầu tiên cần xem lại kỹ năng thực nghiệm của bạn và độ sạch của các thành phần phản ứng.

 

[Homosapiens]

So sánh như vậy khập khiễng quá

Chào Dontcry,
Theo mình, so sánh như vậy là bình thường chứ có khập khiểng gì đâu (có thể Dontcry chưa hiểu ý mình chăng !). Đúng là xác định SNP, Allelic Discrimination, nghiên cứu sự biểu hiện của gen... là những ứng dụng rất lớn của real time PCR, nhưng lĩnh vực chẩn đóan bệnh truyền nhiễm (tác nhân là vk, virus...) cũng là một cũng là một trong những ứng dụng mạnh của kỹ thuật này. Do đó viềc lựa chọn SYBR Green I hay Taqman probe hay molecular baecons hay scorpions...cho phản ứng là tùy vào chúng ta. Do đó cho dù là Taqman probe hay SYBR Green I thì vẫn có thể ứng dụng để định lượng nucleic acid, chứ không phải

Tagman Probe (Hydrolysis Probe) ứng dụng chủ yếu để xác định đột biến: SNP, Allelic Discrimination

SYBR Green I ứng dụng để làm định lượng. Có thể tính ra đến số lượng bản copy của template nếu có mẫu làm đường chuẩn.

như bạn nói đâu. Và khi đó chúng ta có thể so sánh độ nhạy của các pp này chứ. Bằng chứng là ở Wellcome Trust (TPHCM) họ cũng có làm rồi đấy (nhưng kq thế nào mình không biết )

Về độ nhạy của SYBR Green I thì khỏi nói. Cực kỳ chính xác

Ý của mình độ nhạy (sensitivity) tức là lượng copy ban đầu thấp nhất mà pư có thể phát hiện. Còn từ "chính xác" thì phải dùng cho specificity của pư chứ.
Theo mình SYBR green I chỉ có độ chính xác trong một giới hạn nào đó thôi chứ không hẳn là "cực kỳ chính xác " đâu (cho dù có phân tích melt curve) bởi vì nó là intercalating dye mà. Nếu nói về độ chính xác thì các probe phát hùynh quang mới là "sư phụ".
Mà thôi homosapiens chỉ xin mạn phép linh tinh thế thôi chứ em (vì đang là ét dzê mà :wink: ) biết trên forum này có nhiều người giỏi lắm. À mà trang web này hay wá hà
Mong nhận được sự học hỏi từ các anh chị và các bạn.

 

[Dương Văn Cường]

Theo mình nghĩ, để so sánh một cái A với 1 cái B thì nhất thiết phải có những tiêu chí mà cả hai cái cùng hướng đến.

Dĩ nhiên, các assay sử dụng probe của Realtime có thể ứng dụng làm định lượng và ngược lại, thậm chí SYBR có thể dùng để xác định đột biến. Tuy nhiên, mình chưa bao giờ nghĩ đến việc có ai đó lại đi so sánh chúng với nhau, và so sánh ở điểm gì ?
Ví dụ: So sánh tốc độ của một cái máy cày và một xe đua công thức 1. Rõ ràng cái máy cày cũng là một loại xe cơ giới, có động cơ, dùng xăng ... giống như cái xe đua

Bây giờ, quay lại vấn đề chính mà cả tôi và bạn cùng quan tâm: Độ nhạy (số copy tối thiểu trong template mà phản ứng có thể phát hiện)
- Với SYBR Green I: Độ nhạy không phụ thuộc vào SYBR mà phụ thuộc vào các yếu tố khác của một phản ứng PCR thông thường: Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách của mẫu, chất lượng buffer, enzyme ...
- Với Hybridization probe & Hydrolysis probe: Cũng như vậy. Độ nhạy của phản ứng cũng không phụ thuộc vào probe. Nếu primers làm tốt chức năng của nó thì sẽ có sản phẩm PCR, còn việc probe có làm việc trên cái sản phẩm PCR đó hay không thì là chuyện khác.

Vấn đề thứ hai là độ chính xác (specificity) của phản ứng Realtime: Tôi nghĩ nếu cần so sánh thì đây có thể là chỗ để chúng ta làm những thí nghiệm so sánh. Ví dụ: So sánh khả năng phát hiện đột biến giữa Hybridization probe, Hydrolysis probe và SYBR Green I.
(Ngay cả trong trường hợp cụ thể này, việc so sánh giữa các loại probe với SYBR green cũng vẫn rất khập khiễng vì cách thưc tiến hành thí nghiệm là khác nhau).

Nghe người ta nói real time PCR sử dụng SYBR Green I có độ nhạy cao hơn real time PCR sử dụng Taqman probe, molecular beacons... điều này có đúng không ? (theo mình nghĩ về lý thuyết có thể đúng nhưng không biết thực nghiệm ntn, các bạn có ai đã so sánh thử chưa).

Giả sử tôi chưa hiểu chính xác ý mà homosapiens muốn đề cập. Bạn nói rằng bạn đã nghĩ về lý thuyết có thể đúng ... Vậy, tốt nhất, bạn đã nghĩ thế nào thì hãy trình bày trong 1 bài viết đi, nói rõ cả nguyên lý cơ bản nhé.

 

[Dương Văn Cường]

Nếu hiểu độ nhạy theo nghĩa khả năng phát huỳnh quang dựa trên sự có mặt của số lượng bản copy của DNA mach kép (hoặc nồng độ - tùy bạn), tạm ký hiệu là X, đối với SYBR Green I, và số lượng probe liên kết với mạch đích, tạm ký hiệu là Y, đối với các assay dùng probe, thì có 2 điểm thế này:

- Việc tăng lượng X hay Y rất đơn giản chỉ bằng cách tăng số chu kỳ PCR.
- Khả năng phát huỳnh quang của SYBR Green I là rất cao. Tôi đã làm một thí nghiệm mà đỉnh (pick) của Primer Dimer cũng cao gần bằng pick của sản phẩm. Liệu có phải homosapiens nghĩ rằng độ nhạy của các assay dùng SYBR Green I có thể cao hơn các assay khác là theo hướng này không ?


------------


Hiện tôi được biết có 2 hệ thống Realtime chính là LightCycler của Roche và ABI Prism của Applied Biosystem. Có thể còn nhiều loại khác nữa nhưng tôi không biết, bạn nào biết thì bổ xung.

Hệ thống LightCycler có một số ưu điểm chính so với ABI Prism:
- Sử dụng bộ phận gia nhiệt bằng luồng khí nóng => nhanh hơn so với gia nhiệt block như các máy PCR thường và ABI Prism vẫn dùng.
- Có thể áp dụng Hibridization probe assay, còn ABI Prism thì không. Đây là một ưu điểm cực lớn.
- Sử dụng ống mao quản (capilary) để chạy mẫu, có nắp đóng kín => giảm nguy cơ nhiễm.
- Allelic Discrimination phân biệt theo pick => rất rõ ràng.
- Tự động tính toán Ct => đỡ mệt.

Trước đây tôi có chạy demo bằng ABI Prism thì thấy có mấy điểm rất đáng lưu ý:
- Khả năng nhiễm rất cao do sử dụng plate để mix mẫu.
- Kết quả Allelic Discrimination đánh giá theo các vùng nên tương đối mệt lúc phân tích và làm cho người ta không cảm thấy thật sự thoải mái khi kết luận.
- Bắt buộc phải dùng Hydrolysis probe nên lúc thiết kế thí nghiệm nhiều khi bị ràng buộc. Hybridization probe thì khác hẳn.
- Tính toán, thay đổi giá trị Ct => thêm 1 bước loằng ngoằng không thực sự cần thiết. Lưu ý: Hệ thống LightCycler vẫn có thể tự điều chỉnh Ct nếu bạn thích.


Nếu cần so sánh cái gì đó, thì đây là những so sánh đáng giá nhất mà chúng ta nên làm để có thể mua được hệ thống phù hợp cho Lab của mình.

Những so sánh này nếu tự tôi mò mẫm chăc cũng còn lâu mới hiểu được những cái hay cái dở của nó. Rất may tôi được sếp chỉ dẫn. Cảm ơn sếp

 

[Nguyễn Trường Khoa]

Chào các anh, các chi và mọi người.
Em thâý chủ đề này hay quá nhưng em vẫn chưa biết nhiều về Realtime PCR. các bác chi cho em biet với.
Cảm ơn các bác nhiều

 

[Thành viên cũ]

Chào các bác:

Em có một câu hỏi nhỏ, các bác nói là sử dụng tín hiệu phát huỳnh quang để nhận biết các gen. Vậy các bác đánh dấu huỳnh quang các gen như thế nào vì các đoạn gen không có khả năng phát huỳnh quang đâu

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em có một câu hỏi nhỏ, các bác nói là sử dụng tín hiệu phát huỳnh quang để nhận biết các gen. Vậy các bác đánh dấu huỳnh quang các gen như thế nào vì các đoạn gen không có khả năng phát huỳnh quang đâu

Bản thân đoạn gene không phát huỳnh quang thì người ta cho chất phát huỳnh quang vào theo cơ chế gắn xen hoặc dùng mẫu dò có gắn chất phát huỳnh quang, khi mẫu dò này gắn vào gene đích thì ta sẽ đo được tín hiệu phát quang.

 

[sv_ngheo]

thậm chí SYBR có thể dùng để xác định đột biến.


- Với SYBR Green I: Độ nhạy không phụ thuộc vào SYBR mà phụ thuộc vào các yếu tố khác của một phản ứng PCR thông thường: Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách của mẫu, chất lượng buffer, enzyme ...

Trời đất ơi, làm sao mà người ta có thể dùng SYBR để xác định đột biến nhỉ, xin dontcry chỉ giáo dùm. Và tiện đây xin chỉ giáo luôn là bằng cách nào có thể chỉ chỉnh điều kiện của pứ PCR thông thường mà tăng được độ nhạy của SYBR..

Mai mình sẽ dùng EtBR để xác định đột biến, chỉ cần chỉnh mấy cái điều kiện Mồi, nhiệt độ bắt cặp, độ sách của mẫu, chất lượng buffer, enzyme ... là OK.


Làm khoa học dễ dàng như ăn cháo vậy !!!!

 

[Dương Văn Cường]

1. Vụ dùng SYBR Green I để xác định đột biến là có thật, nhưng nó giống như cái máy cày ý Để tôi lục lại tài liệu, đọc lại 1 tí rồi sẽ post sau nhé. Lưu ý lại 1 lần nữa: Tôi không chỉ giáo ai hết, chúng ta cùng thảo luận, có gì sai thì cùng sửa. OK.

2.

Và tiện đây xin chỉ giáo luôn là bằng cách nào có thể chỉ chỉnh điều kiện của pứ PCR thông thường mà tăng được độ nhạy của SYBR..

Làm ơn đọc kỹ lại những gì tôi viết. Bạn hiểu sai vấn đề rồi, hoặc chí ít là hiểu sai ý tôi định nói.

Làm khoa học dễ dàng như ăn cháo vậy !!!!

Lại có gì bức xúc hay sao vậy? Trời 39 40 độ cháo cũng không ăn nổi đâu.

 

[sv_ngheo]

Kể cả ngồi trong bếp lò 45 độ mà xơi cháo để giải quyết được công việc thì cũng OK chứ, đáng gì so với cái mình định làm, phải không nào.


Thực ra xét về độ nhạy, nên đặt ở điều kiện chuẩn cho một pứ PCR thông thường mà nói, và như vậy các điều kiện đó không ảnh hưởng nhiều đến độ nhạy (đó là theo tôi làm thực nghiệm mà rút ra như vậy !)

Đợi bài trả lời của bạn - và mọi người

 

[Dương Văn Cường]

sv_ngheo đọc bài này nhé.

 

[sv_ngheo]

Bài này minh họa cho việc sử dụng melting curve để xác định Tm của đoạn sp PCR. Dĩ nhiên SYBR chỉ được dùng để đo lệch giữa độ phát huỳnh quang của sp có và không có đột biến . Nhưng mà doncry không biết chứ làm thế nào để xác định được độ chênh lệch chỉ 1 nucleotide này là cả một vấn đề. Không tin hỏi thử anh Aigu xem.

Dựa vào Tm để xác định độ dài amplicon bằng melting curve là một điều gần như không tưởng nếu chỉ chênh lệch 1 nu.

 

[Dương Văn Cường]

Dựa vào Tm để xác định độ dài amplicon bằng melting curve là một điều gần như không tưởng nếu chỉ chênh lệch 1 nu.

Chính xác.

Đây là câu trả lời từ Roche.

Question
Mutation Analysis using Sybr Green I Detection Format

B]Answer[/B]
It is very unlikely that single point mutation analysis with SybrGreen I of up to 400 bp sized fragments is possible with the LC. Analysis may be possible for fragments up to 50 bp (no data available).

In theory a single mutation that leads to a decrease or increase in melting behavior of 1 degree can be distinguished . The longest fragment where such a temperature difference could be resolved by using the SybrGreen I detection format was 50 bp long. For this reason the SybrGreen I format be the only suitable one for the screening of larger deletion mutations, but no in house experience is created in this field.

In general we recommend the Hybridisation Probe format for mutation analysis.

Về lý thuyết, đột biến điểm có thể được xác định bằng SBGR Green nếu nó có thể làm thay đổi nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm ít nhất 1 độ C. Tuy nhiên, trên thực tế điều này là khôgn tưởng.

Vấn đề ở đây là sv_ngheo không phân biệt "Xác định đột biến điểm" và "Xác định đột biến". Nếu dùng SYBR GREEN có thể phát hiện được đột biến mất đoạn như trong bài báo đã viết. Việc sử dụng SYBR GREEN để làm điều này có ưu thế hơn so với sử dụng PCR thông thường như thế nào ? Liệu sv_nghèo có vui lòng nói cho mọi người rõ ? 8)

 

[sv_ngheo]

Về nguyên tắc chung, xác định đột biến mất đoạn trở nên dễ dàng hơn thằng cha SNP kia nhiều lần. Vì đơn giản rằng Tm của dạng ko đột biến sẽ cao hơn Tm của dạng mất đoạn.

SYBR cũng chẳng phải là cái gì ghê gớm cả, nôm na nó chỉ là EtBr loại tốt thôi, quan trọng là phải ép con ngựa này chạy theo ý của ta. Loại dye cài xen này rất khó chịu, vì cứ có DNA sợi kép là thôi rồi, phát huỳnh quang ầm ầm. Như mọi người đã biết, trong quá trình PCR chuyện unspecific product là chuyện thường ngày ở huyện. SYBR cứ thấy có người đến là hót ầm lên “Có khách, có khách” lắm khi thằng kẻ trộm cũng được đón chào !

Vì vậy để xác định đột biến mất đoạn thì nôm na nó theo hướng như vầy: Design lấy đôi primer bao lấy vị trí mất đoạn, càng đặc hiệu càng ổn. Sau đó setup một phản ứng PCR bình thường, có thêm SYBR trong đó. Cho mẫu vào real-time PCR machine -nhớ chọn melting curve. Ở bước Mcurve này sẽ thấy độ đổ dốc của amplicon đột biến và không đột biến khác nhau. Khác bi nhiêu là tùy đoạn mất dài hay ngắn. Nhưng nói chung dưới 10 nu thì đừng hi vọng. Tốt nhất nên chuyển sang dùng pp khác. Mà pp khác thì vô khối, sao mà những người phát minh ra chúng tài năng vậy không biết. ! Kể cả PCR thông thường cũng phát hiện được mới tài !

 

[Dương Văn Cường]

Ở bước Mcurve này sẽ thấy độ đổ dốc của amplicon đột biến và không đột biến khác nhau.

Đúng rồi. Điểm khác biệt cơ bản thứ nhất khi sử dụng SYBR Green để xác định đột biết mất đoạn / thêm đoạn là ở chỗ này.

Nếu là PCR bình thường, người ta phải thiết kế primer nằm trên vị trí đột biết. Nếu xảy ra đột biến thì primer không bám được vào và sẽ không có sản phẩm.

Còn Realtime thì khác. Như sv_ngheo đã nói là cặp mồi sẽ bao lấy vị trí đột biến. Trong trường hợp này, dù mẫu là đột biến hay kiểu dại thì vẫn luôn luôn có sản phẩm, nhưng khi phân tích Melting Peaks thì sẽ thấy Tm của hai sản phẩm khác nhau.

(1) Rõ ràng, việc kết luận dựa trên sự có hay không có sản phẩm PCR là không an toàn, đặc biệt trong ứng dụng thực tế, khi mà nơi làm phản ứng PCR không được trang bị như ở các Lab Sinh học phân tử chính thống và người làm pư PCR lại không phải là những cán bộ nghiên cứu. Sản phẩm pư không xuất hiện phụ thuộc rất nhiều vào những yếu tố khác chứ không chỉ riêng là do DNA template bị mất cái đoạn đó.

(2) Việc kết luận dựa trên Melting Curves Analysis thì có thể nói chính xác đến 100%. Tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến (1) đều không có tác dụng với Realtime trong việc đưa ra kết luận.

Điểm khác biệt cơ bản thứ 2 khiến cho Realtime trở nên ưu việt hơn PCR thông thường rất rất nhiều, đó là Realtime có thể kết luận mẫu phản ứng là đồng hợp tử hay dị hợp tử dựa trên phân tích Melting curve. Dĩ nhiên, chiến đấu end point với vũ khí là điện di trên gel agarose thì không thể làm được điều này.

Ngoài ra, một vài ưu thế lặt vặt khác như thời gian, công sức ... cũng nên được kể ra.

Đặc biệt: SYBR GREEN I không hề đắt.

 

[sv_ngheo]

người làm pư PCR lại không phải là những cán bộ nghiên cứu.

Việc kết luận dựa trên Melting Curves Analysis thì có thể nói chính xác đến 100%.

Điểm khác biệt cơ bản thứ 2 khiến cho Realtime trở nên ưu việt hơn PCR thông thường rất rất nhiều, đó là Realtime có thể kết luận mẫu phản ứng là đồng hợp tử hay dị hợp tử dựa trên phân tích Melting curve. Dĩ nhiên, chiến đấu end point với vũ khí là điện di trên gel agarose thì không thể làm được điều này.


Đặc biệt: SYBR GREEN I không hề đắt.

Người làm PCR ko là cán bộ nghiên cứu thì là ai ? Hay là thuê cửu vạn ở ngoài vào làm ???

Kết luận dựa trên MC chưa hẳn đã là chính xác tuyệt đối, vì MC chỉ báo có hay không có sp, tập hợp các đoạn đó nó có Tm khoảng bao nhiêu. Tất nhiên trường hợp đoạn oligonu ngắn mà có %GC cao thì cũng có thể trùng Tm với đoạn dài mà %AT cao. Thằng MC này chỉ dựa vào Tm thì chẳng thể nào tin tưởng nó được. ! Be careful !

Ai bảo agarose không kết luận được homo hay hetero, bậy, 3% Nusieve overnight tách được cỡ 20nu....

SYBR GREEN I giá bi nhiêu mà rẻ, toàn nói bậy ! Cho biểu giá tính trên đơn vị pứ PCR đơn coi !

Nói chung không nên phát biểu liều, cứ kinh nghiệm thực tế mà trao đổi !