Realtime PCR: Hỏi đáp

[Hunga081206]

Hybridization probe & Hydrolysis probe

Các bạn có thể giúp mình phân biệt:
1. Nguyên lý hoạt động
2. Những ứng dụng

Của 2 mồi trên dùng trong Realtime PCR

 

[mnhung]

Em doc thay RT-PCR la de dinh luong nhung neu sau 1 so chu ky nhat dinh thi cac sang pham dat nguong Plateau. Vay thi dinh luong o thoi diem nao (sau bao nhieu cycle) la hop ly va chinh xac nhat? Va nguoi ta so sanh bang copy number hay Ct?
Va e thay khi danh gia dinh luong, co the do loi pipet luong DNA dua vao co the khac nhau, vay ket qua ko con chinh xac nua? Va lam cach nao de set up standard
Em do' mai ma ko danh duoc tieng Viet co dau, mong anh chi thong cam.
Thanks

Theo mình nghĩ thì trong RT-PCR có đường chuẩn và bạn định lương thông qua đường chuẩn tại chu kì mà đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm ngang.Có gì mong cả nhà góp ý

 

[Bùi Anh Tuấn]

Mọi người ở thame này đang bàn luận về kỹ thuật real-time sử dụng hệ thống máy real-time PCR. Xin hỏi các bậc tiền bối, kỹ thuật phân tích động học (kinetic, cyclic) trong real-time.
Có một hướng mới để bổ xung nâng cấp các máy PCR thông thường thành một hệ thống real-time bằng cách bổ xung thiết bị đọc huỳnh quang và một PC. Điều này làm giảm chi phí đầu tư một hệ thống realtimePCR đắt tiền rất nhiều. Nhưng vấn đề ở đây, mình muốn làm sáng tỏ là tính năng nhìn được real run curve trong hệ thống real-time so với chỉ phân tích, phát hiện ở end-point detection?????

 

[Trương Hiền Hạnh]

Lâu lâu ngồi lục lại chơi chơi ... Em đang có 1 course về Realtime, có điều khi đọc phần anh Cường viết TaqMan chỉ sử dụng để xác định điểm đột biến thì ko đồng tình với anh lắm.
Khóa học của em về xác định hàm lượng GMO trong các sản phẩm thực phẩm bởi Châu Âu có quy định phải dán nhãn mác về thành phần GMO chứa trong sản phẩm. Một số phòng thí nghiệm "làm dịch vụ" ở đây họ cho rằng TaqMan làm nhiệm vụ định lượng này tốt hơn so với SYBR. Bởi lẽ SYBR có khả năng gắn với primer nếu có hiện tượng dimer, gây nhiễu cho phản ứng.
Anh Cường ơi, em ngu muội, mong anh lục lại cái topic cũ rích nì và chỉ giáo!

 

[labiotech]

Bên mình có SYBR của hãng KAPPA, giá thấp hơn so với những hãng khác, nếu Hà Thị Minh Thi có nhu cầu thì cho mình email, mình sẽ gửi thông tin, tài liệu cho bạn.

 

[Ho Huu Tho]

Enzym Reverse transcriptase có ức chế phản ứng PCR không?

Sản phẩm của phản ứng Reverse transctription sẽ được dùng làm template cho một số phản ứng Realtime PCR. Ngoài cDNA vừa được tổng hợp, còn bị lẫn enzyme reverse transcriptase, được biết là ức chế hoạt động của phản ứng PCR. Vậy theo các bạn sự ức chế này có ảnh hưởng như thế nào đến độ chính xác trong việc định lượng của Realtime PCR. Và làm thế nào để khắc phục nó nếu điều này thực sự ảnh hưởn đến độ chính xác.

 

[nhancnsh]

ứng dụng của PCR

Em có 1 vấn đề cần hỏi, mong các anh chị giải đáp giup e.
Em thấy ứng dung củ PCR và Realtime PCR có nhiều điểm giống nhau, như cùng được dùng để nghien cứu biểu hiện gen, phân tích genome...Ai có thể phân biệt rõ cho em những ứng dụng của PCR chuẩn và Realtime PCR không?

 

[Ho Huu Tho]

Em có 1 vấn đề cần hỏi, mong các anh chị giải đáp giup e.
Em thấy ứng dung củ PCR và Realtime PCR có nhiều điểm giống nhau, như cùng được dùng để nghien cứu biểu hiện gen, phân tích genome...Ai có thể phân biệt rõ cho em những ứng dụng của PCR chuẩn và Realtime PCR không?

Theo mình nghĩ:
So với PCR thường thì Realtime PCR có khả năng định lương tốt hơn và có độ nhạy (và có thể cả độ đặc hiệu) cao hơn, nhưng lại cần thiết bị hiện đại hơn và hóa chất tiêu hao đắt tiền hơn. Từ đó ta có thể dễ dàng phân biệt được ứng dụng của hai kỹ thuật này bạn ạ.

 

[nhancnsh]

E cảm ơn bạn nhiều nha.
Cho e hỏi thêm nữa về nguyên li hoạt động của máy PCR, có phải theo hiệu ứn PELTIER không? Nghĩa là: Buồng ủ nhiệt được làm bằng kim loại dẫn nhiệt cao, đặt trên 1 thiết bị peltier có cấu tạo là 2 mảnh kim loại đặc biệt đặt áp vào nhau, 2 mảnh này được nối với 2 cực của nguồn điện và được điều chỉnh tự động để chiều của dòng điện đi qua thiết bị được thay đổi theo chiều này hay theo chiều ngược lại. Chính sự đổi chiều dòng điện đã làm cho 2 mảnh kim loại của thiết bị peltier nóng lên ở mặt này và lạnh đi ở mặt khác sẽ bị đảo ngược lại nhiệt độ, nghĩa là mặt nóng sẽ bị lạnh và mặt lạnh sẽ bị nóng lên. Như vậy chu kì nhiệt mà người sử dụng nhập vào sẽ được bộ vi xử lí của máy sử dụng để điều khiển chiều và cường độ dòng điện đi qua 2 mảnh kim loại của thiết bị peltier, làm cho buồng ủ nhiệt được lên xuống nhiệt độ theo chu kì đã nhập vào.
Em đang học về phần này nhưng chỉ tìm tài liệu được chừng ấy. Các anh chị bổ sung cho em với nha

 

[nhancnsh]

ah cho em hoi cach upload bai nhu the nao vay?

 

[nvhung]

Theo mình nghĩ:
So với PCR thường thì Realtime PCR có khả năng định lương tốt hơn và có độ nhạy (và có thể cả độ đặc hiệu) cao hơn, nhưng lại cần thiết bị hiện đại hơn và hóa chất tiêu hao đắt tiền hơn. Từ đó ta có thể dễ dàng phân biệt được ứng dụng của hai kỹ thuật này bạn ạ.

Mình có một số góp ý về phần này ha.
real-time PCR là một cải biến của PCR thồng thống. Vì vậy về độ đặc hiệu không có sự khác biệt giữa PCR và Real-time PCR, mà độ đặc hiệu do chính primer và việc tối ưu hóa quy trình quyết định. Real-time PCR có ưu điểm hơn so với PCR truyền thống là: Độ nhạy cao hơn, có thể sử dụng để định lượng tuyệt đối dựa trên tín hiệu huỳnh quang khi chạy cùng với đường chuẩn, trong khi đó PCR truyền thống chỉ có thể định lượng một cách tương đối dựa vào cường độ sáng trên band điện di. và real-time PCR giúp rút ngắn thời gian làm thí nghiệm hơn so với PCR truyền thống do không phải trải qua các bước phân tích sau PCR........

 

[Ho Huu Tho]

Mình có một số góp ý về phần này ha.
real-time PCR là một cải biến của PCR thồng thống. Vì vậy về độ đặc hiệu không có sự khác biệt giữa PCR và Real-time PCR, mà độ đặc hiệu do chính primer và việc tối ưu hóa quy trình quyết định. Real-time PCR có ưu điểm hơn so với PCR truyền thống là: Độ nhạy cao hơn, có thể sử dụng để định lượng tuyệt đối dựa trên tín hiệu huỳnh quang khi chạy cùng với đường chuẩn, trong khi đó PCR truyền thống chỉ có thể định lượng một cách tương đối dựa vào cường độ sáng trên band điện di. và real-time PCR giúp rút ngắn thời gian làm thí nghiệm hơn so với PCR truyền thống do không phải trải qua các bước phân tích sau PCR........

Bạn có chắc chắn về phần in đậm không?

 

[nvhung]

Bạn có chắc chắn về phần in đậm không?

Theo kinh nghiệm và hiểu biết của mình thì là như vậy. mặc dù có một số kiến giải là do real-time PCR sử dụng probe đặc hiệu nên sẽ tăng cường độ đặc hiệu hơn so với PCR truyền thống. nhưng mình nghĩ không hẳn là vậy. Nếu bạn có tài liệu nào chứng minh điều đó thì mình sẽ ghi nhận sự thiếu sót về hiểu biết của mình

 

[Ho Huu Tho]

Theo kinh nghiệm và hiểu biết của mình thì là như vậy. mặc dù có một số kiến giải là do real-time PCR sử dụng probe đặc hiệu nên sẽ tăng cường độ đặc hiệu hơn so với PCR truyền thống. nhưng mình nghĩ không hẳn là vậy. Nếu bạn có tài liệu nào chứng minh điều đó thì mình sẽ ghi nhận sự thiếu sót về hiểu biết của mình

Bạn giải thích rõ hơn ý bạn muốn nói trong phần in đậm được không?

 

[nvhung]

Bạn giải thích rõ hơn ý bạn muốn nói trong phần in đậm được không?

ở đây mình chỉ đưa ra chủ kiến của mình dựa trên kinh nghiệm và sự hiểu biết của bản thân. tức là theo mình không có sự khác biệt nhiều giữa PCR truyền thống và Real-time PCR về độ đặc hiệu.

 

[Ho Huu Tho]

ở đây mình chỉ đưa ra chủ kiến của mình dựa trên kinh nghiệm và sự hiểu biết của bản thân. tức là theo mình không có sự khác biệt nhiều giữa PCR truyền thống và Real-time PCR về độ đặc hiệu.

PCR phát hiện được một trình tự quan tâm dựa vào việc phát hiện được sản phẩm khuếch đại trên gel điện di. Vậy độ đặc hiệu của nó dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu của cặp mồi cộng thêm với xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại trên gel điện di. Tuy nhiên, kích thước của sản phẩm PCR xác định trên gel điện di, đặc biệt là điện di agarose hay điện di acrilamide bản nhỏ có độ phân giải không cao.
Ngược lại, Độ đặc hiệu của Realtime PCR thì khác, ngoài sự đặc hiệu của cặp mồi còn được cộng thêm độ đặc hiệu của trình tự probe nằm giữa hai mồi. Xác suất để một đoạn ADN nào khác được nhân lên bởi cặp mồi lại có thể bắt cặp bổ sung với trình tự của probe sẽ nhỏ hơn rất nhiều, chính điều này làm cho Realtime PCR có độ đặc hiệu cao hơn (ngay cả sản phẩm PCR được khuếch đại nhầm có cùng kích thước với sản phẩm quan tâm thì cũng không có tín hiệu phát ra!). Ngoài ra, Realtime PCR còn có thể giúp chúng ta xác định được Tm của sản phẩm PCR cũng là yếu tố làm cho nó đặc hiệu hơn so với PCR truyền thống bạn ạ.
Tóm lại, Realtime PCR có thể sẽ đặc hiệu hơn PCR truyền thống.

 

[nvhung]

PCR phát hiện được một trình tự quan tâm dựa vào việc phát hiện được sản phẩm khuếch đại trên gel điện di. Vậy độ đặc hiệu của nó dựa vào sự bắt cặp đặc hiệu của cặp mồi cộng thêm với xác định kích thước của sản phẩm khuếch đại trên gel điện di. Tuy nhiên, kích thước của sản phẩm PCR xác định trên gel điện di, đặc biệt là điện di agarose hay điện di acrilamide bản nhỏ có độ phân giải không cao.
Ngược lại, Độ đặc hiệu của Realtime PCR thì khác, ngoài sự đặc hiệu của cặp mồi còn được cộng thêm độ đặc hiệu của trình tự probe nằm giữa hai mồi. Xác suất để một đoạn ADN nào khác được nhân lên bởi cặp mồi lại có thể bắt cặp bổ sung với trình tự của probe sẽ nhỏ hơn rất nhiều, chính điều này làm cho Realtime PCR có độ đặc hiệu cao hơn (ngay cả sản phẩm PCR được khuếch đại nhầm có cùng kích thước với sản phẩm quan tâm thì cũng không có tín hiệu phát ra!). Ngoài ra, Realtime PCR còn có thể giúp chúng ta xác định được Tm của sản phẩm PCR cũng là yếu tố làm cho nó đặc hiệu hơn so với PCR truyền thống bạn ạ.
Tóm lại, Realtime PCR có thể sẽ đặc hiệu hơn PCR truyền thống.

ở đây những lý giải của bạn rất là thuyết phục về mặt học thuật. những thực nghiệm thì không hề đơn giản như vậy. ngay cả việc dùng phân tích Melt curve để xác định Tm củng phụ thuộc khá lớn vào việc bạn dùng thiết bị của hãng nào

 

[Ho Huu Tho]

ở đây những lý giải của bạn rất là thuyết phục về mặt học thuật. những thực nghiệm thì không hề đơn giản như vậy. ngay cả việc dùng phân tích Melt curve để xác định Tm củng phụ thuộc khá lớn vào việc bạn dùng thiết bị của hãng nào

Bạn thông cảm vì chắc mình chưa có nhiều điều kiện làm thực nghiệm được nhiều nên hiểu chưa rõ phần in đậm của bạn. Bạn có thể cho mình biết những kinh nghiệm và hiểu biết thực tế của bạn về mức độ khác biệt khi xác định Tm của sản phẩm PCR bằng các thiết bị của các hãng khác nhau được không?

 

[nvhung]

Bạn thông cảm vì chắc mình chưa có nhiều điều kiện làm thực nghiệm được nhiều nên hiểu chưa rõ phần in đậm của bạn. Bạn có thể cho mình biết những kinh nghiệm và hiểu biết thực tế của bạn về mức độ khác biệt khi xác định Tm của sản phẩm PCR bằng các thiết bị của các hãng khác nhau được không?

Vì tùy theo thiết bị của từng hãng mà " Melt curve peak" có thể lệch nhau khoảng 0.5 tới 1.0 độ C. Vì vậy nếu không cẩn thận và có kinh nghiệm dễ đưa ra kết luận không hợp lý khi làm thí nghiệm trên thiết bị của hãng này rồi sau đó chuyển giao ứng dụng lại chạy trên thiết bị của hãng khác.

 

[trungtien1088]

Phản ứng PCR đinh danh vsv thì yếu tố nào là quan trọng nhất
a. Thiết bị KT đời mơi
b. Mồi đặc hiệu
c. Chủng giống thuân khiết
d. Ca 3 ý trên
Theo mình là B, bạn nghĩ sao????