Kết quả PCR phập phù và thấp

[Trịnh Thành Trung]

Mình đang tách chiết ADN từ eubacteria theo phương pháp DNeasy tissue kit, Qiagen. Sau đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen mong muốn. Mình không hiểu sao kết quả PCR rất chán, lúc được, lúc không.
Sau đó mình tiến hành đo nồng độ ADN. kết quả thu được như sau:

Sample PCR result A 260 A 280 DNA con.      Purity
                                                                                      (ng/ul)
1 Positive 0,047 0,021 117,5 0,44
2 Positive 0,028 0,013 70 0,46
3 Positive 0,023 0,011 57,5 0,47
4 Negative 0,030 0,014 75 0,46
5 Negative 0,037 0,018 92,5 0,48
6 Negative 0,036 0,016 90 0,44
7 Negative 0,025 0,011 62,5 0,44

Các mẫu đảm bảo làm cùng trong một thời gian, cùng điều kiện phản ứng như nhau, thậm chí mixture reaction of PCR được hòa trộn cùng vào nhau trước khi đưa DNA khuôn vào. Thể tích phản ứng PCR là 50ul, DNA khuôn là 7ul với mỗi phản ứng.
Câu hỏi:
1. vì sao hiệu quả của PCR lại thấp thế (đảm bảo cặp mồi đặc hiệu với chủng nghiên cứu)

2. Mình không biết vì sao cái Purity nó lại như thế (đây là lần đầu tiên trong đời làm cái thí nghiệm này nên không biết kết quả sai đó do mình hay do máy đo???). kết quả tính toán dựa trên Website sau đây:

http://matcmadison.edu/biotech/resources/methods/labManual/unit_4/exercise_15.htm

Bạn nào có nhiều kinh nghiệm trong lĩnh vực này ra tay giúp mình với.

Cám ơn rất nhiều.

P/S: Trời ơi, không biết làm cách nào để chèn cái bảng vào bài viết, các bạn chịu khó down load attached file nhé!

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

1. Tách DNA bằng kit mà độ tinh sạch quá thấp như vậy thì cần xem lại.
Nhưng thật ra với eubacteria thì độ tinh sạch của DNA thường cũng không ảnh hưởng nhiều lắm đến kết quả phản ứng PCR. Với đa số eubacteria tôi chỉ cần dùng dung dịch đệm thích hợp, đun 100oC 10', ly tâm rồi dùng dịch nổi chạy PCR, kết quả vẫn tốt.

2. Với nồng độ DNA đo được cao như vậy mà dùng 7ul làm template là quá nhiều. Bạn đã thử dùng nồng độ template ít hơn chưa?

3. Primer thiết kế đặc hiệu chưa chắc đã là primer tốt cho mục tiêu của bạn. Còn rất nhiều vần đề cần tính đến với primer.

4. Bạn đã thí nghiệm với một dải nhiệt độ gắn mồi chưa?

 

[Dương Văn Cường]

2. Với nồng độ DNA đo được cao như vậy mà dùng 7ul làm template là quá nhiều. Bạn đã thử dùng nồng độ template ít hơn chưa?

Bổ xung thêm thông tin nhé, mình xem trong cuốn Molecular Cloning, A Laboratory Manual mục 8.6:


The typical amount of yeast, bacterial, and plasmid DNAs used per reaction are 10ng, 1ng, and 1pg, respectively.

 

[Vũ Hải Chi]

Loại trừ yếu tố: hóa chất và thiết bị, bác có thể kiểm tra "kết quả pcr lúc ra, lúc không" bằng cách xin đâu đó một ít pcr mix về dùng đối chứng thử xem.

 

[Phạm Thủy Trang]

Kết quả PCR có thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố lắm. Bạn đã tối ưu hóa PCR chưa? Đã kiểm tra khả năng làm việc tốt của tất cả các hóa chất, thiết bị chưa? Có thể do đối tượng thí nghiệm của bạn đặc biệt không? (chẳng hạn nó có chứa chất ức chế PCR). Ngày trước mình làm với đối tượng là nấm linh chi, cũng chứa nhiều chất ức chế PCR lắm. Dùng kit không tinh sạch nổi ADN để chạy PCR. Nên phải tự tìm ra protocol riêng. Rồi kại phải tối ưu hóa PCR nữa, khá mệt. Mình không rành lắm về vi khuẩn nên chỉ đưa ra các khả năng này.
A, bạn có thể kiểm tra bằng đối chứng dương và âm xem sao.

 

[Vũ Hải Chi]

Bác Trung đâu rồi ấy nhi? Chắc thầy bác đang giục chạy PCR à? Bao nhiều kinh nghiệm của mọi người thế này chẳng thấy bác vote gì cả ? .
Dù sao cũng thanks bác, nhờ "câu đố" của bác em mới biết được kit tinh sạch DNA cũng không tinh sạch được DNA, thú vị thật.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

"Dù sao cũng thanks bác, nhờ "câu đố" của bác em mới biết được kit tinh sạch DNA cũng không tinh sạch được DNA, thú vị thật"
Hơi "mít" một chút, câu này phải hiểu thế nào đây?
Theo tôi biết Kit cũng có ba bảy kit, có lẽ phải thử hết mới biết kit nào tốt chứ nghe theo lời công ty thì chắc bán nhà...
To bạn Thủy Trang: chất ức chế PCR là những chất nào? Ức chế thành phần nào?
Bác Dũng ơi, bác chia xẻ kinh nghiệm khi chạy PCR thì yếu tố nào là yếu tố quyết định khi mình không ra kết quả như mong muốn đi, nhất là trong các PCR lặp lại thí nghiệm của tác giả khác (cũng mồi đấy, cũng đ/k chạy đấy, nồng độ template đấy....v.v) mà kết quả lại âm hoặc rất phập phù.

 

[Trần Hoàng Dũng]

To BS Lương: tui nhớ kô lầm tui đã hướng dẫn về PCR trên này cũng kô dưới 2 lần đầu, tui thì kô biết nó nằm ở đâu thôi, BS Lương thử dùng chức năng search choi ra kô?

 

[Vũ Hải Chi]

"Dù sao cũng thanks bác, nhờ "câu đố" của bác em mới biết được kit tinh sạch DNA cũng không tinh sạch được DNA, thú vị thật"
Hơi "mít" một chút, câu này phải hiểu thế nào đây?

Đấy là em nói chung chung, để em lấy VD cụ thể cho bác hiểu nhé: "Dù sao cũng thanks bác, nhờ "câu đố" của bác em mới biết được (kit tinh sạch DNA := QIAamp@ DNA Blood Mini Kit) cũng không tinh sạch được DNA, thú vị thật"
Tất nhiên là không dùng kit "ba bảy" kiểu như bác, mà hôm nào bác cho em xin một ít để em bán nhà mới ? , hãng nào thế hả bác để em thử mới? Chắc bác dùng phải hàng hết hạn rồi or dùng sai ấy chứ , em nghĩ các công ty có tiếng chẳng tuyển các "chú lùn" tham gia nghiên cứu sản xuất sản phẩm đâu.

 

[Vũ Hải Chi]

Đây là 2 chủ đề về bệnh của PCR các bác có thể tham khảo:
http://sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=113
http://sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=1733

 

[Phạm Thủy Trang]

" chất ức chế PCR là những chất nào? Ức chế thành phần nào?

Không hiểu anh hỏi là chất ức chế PCR nói chung hay trong đối tượng em làm. Nếu là chất ức chế nói chung thì khá nhiều. Nếu cần em sẽ gửi anh một danh sách làm ví dụ. Còn trong đối tượng em làm chủ yếu đó là các polysaccharide (cũng chính là thành phần quan trọng tạo nên giá trị dược lý của nấm linh chi). Đây cũng là loại chất ức chế PCR phổ biến có trong thực vật và nấm. Chúng ức chế enzyme polymerase.

 

[Đặng Thị Hương]

oi troi! anh Dũng lại đùa anh Trung rồi. Chẳng hay anh Trung đưa ra câu hỏi để mọi người cẩn thận khi chạy PCR k? nói chung nó ?giúp ích cho mình và cho khối người cũng được đấy chứ. ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đấy là em nói chung chung, để em lấy VD cụ thể cho bác hiểu nhé: "Dù sao cũng thanks bác, nhờ "câu đố" của bác em mới biết được (kit tinh sạch DNA := QIAamp@ DNA Blood Mini Kit) cũng không tinh sạch được DNA, thú vị thật" - Chắc bác dùng phải hàng hết hạn rồi or dùng sai ấy chứ.

Dấu đầu hở đuôi nhé: rõ ràng nói móc họng mấy bạn kia mà cứ ngây thơ như... nai cụ

 

[Trịnh Thành Trung]

1. vì sao hiệu quả của PCR lại thấp thế (đảm bảo cặp mồi đặc hiệu với chủng nghiên cứu)

2. Mình không biết vì sao cái Purity nó lại như thế (đây là lần đầu tiên trong đời làm cái thí nghiệm này nên không biết kết quả sai đó do mình hay do máy đo???). kết quả tính toán dựa trên Website sau đây:

http://matcmadison.edu/biotech/resources/methods/labManual/unit_4/exercise_15.htm

P/S: Trời ơi, không biết làm cách nào để chèn cái bảng vào bài viết, các bạn chịu khó down load attached file nhé!

Kính thưa bà con, tôi, Trịnh Thành Trung, thành thật xin lỗi bà con về bài toán PCR kể trên. Vì 'nhìn gà hóa cuốc' nên Tôi đã đảo lộn tỉ sô hai loại bước sóng 260 và 280 trong công thức tính độ tinh sạch của ADN. Số liệu của bài toán đưa ra rất rõ ràng trong . doc attached file. Sự nhầm nhọt đau đớn này cũng chỉ mong bà con nhận ra hộ Tôi và mắng Tôi vài lời để lần sau có viết cái gì lên diễn đàn thì đừng có 'nhầm lẫn' như thế. Thế nhưng, một sự thật phũ phàng đã xảy ra, chăng có ai mắng Tôi một câu nào cả mà chỉ thấy một số cố gắng chạy theo cắn vào đít tôi vài cái. Đau lắm, nhưng vẫn đành phải chịu. Càng đau hơn là có những cháu nhi đồng thể hiện bản lĩnh trong nghiên cứu gần 10 năm ở EU nhưng vẫn chỉ dạy Tôi rằng 'Mày đã học thuộc lí thuyết chưa mà hỏi??? Mày đã biết cái sờ tay sờ ti 'strategy' chưa mà hỏi???'. Cũng rất may cho Tôi là hồi còn bé đã tiêm phòng một sô loại vacxin điên dại rồi chứ. Nếu không thì tèo mất.
Dù sao thì cũng chân thành cảm ơn một số bạn đã có lời nhắc nhở, gợi ý như bạn Dương Văn Cường (cái của mình là ADN tổng số, không phải plasmid), bạn Vũ Hải Chi và Phạm Thủy Trang,  và bạn Đặng Thu Hương.
Vậy Tôi tạm xin phân chia ra một số loại người tham gia trả lời bài viết sau đây:
Có 7 người trả lời lại bài viết trong đó chỉ có 6 lần file được download, Vậy có nghĩa là
- Có những người chẳng cần đọc rõ bài viết. Chỉ cần biết trong bài có chữ PCR là trả lời vèo vèo theo tinh thần học thuộc bài cũ.
- Có những người có đọc rồi đấy nhưng cũng chẳng phát hiện ra điều gì chỉ biết nói và nói kẻo ngừoi khác lại bảo mình là không biết.
Cũng may có sự nhầm lẫn của Tôi mà Tôi cũng phát hiện ra rằng: Tính professional và expertise của những người tham gia giải bài toán.  

Đến bây giờ Tôi mới càng vỡ lẽ ra cái gọi là 'Khoa học giải đố'. Có lẽ, đất nước chúng ta nên bước lên tầm cao của khoa học giải đố và thuộc lòng các công thức trong lòng bàn tay trước. Còn cái gọi là 'khoa học chính thống' để đưa giá trị lí thuyết vào cuộc sống thì nên đưa vào quên lãng đã.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Khoan nói đến các chuyện khác

Cường trích dẫn:

The typical amount of yeast, bacterial, and plasmid DNAs used per reaction are 10ng, 1ng, and 1pg, respectively.

Số liệu bạn Trung đưa ra:

1 Positive 0,047 0,021 117,5 0,44
2 Positive 0,028 0,013 70 0,46
3 Positive 0,023 0,011 57,5 0,47
4 Negative 0,030 0,014 75 0,46
5 Negative 0,037 0,018 92,5 0,48
6 Negative 0,036 0,016 90 0,44
7 Negative 0,025 0,011 62,5 0,44

Bạn phát Trung biểu:

Dù sao thì cũng chân thành cảm ơn một số bạn đã có lời nhắc nhở, gợi ý như bạn Dương Văn Cường (cái của mình là ADN tổng số, không phải plasmid)

Không hiểu bạn đã đọc kỹ câu Cường trích dẫn chưa?

- Nếu kỹ rồi thì phiền bạn xem lại vì dường như bạn chưa hiểu.

- Nếu chỉ đọc lướt thì cũng đừng bắt người khác đọc kỹ bài của bạn hoặc phải load file của bạn về ngâm cứu.

Tiếp đến rất mong các bạn thận trọng trong ngôn từ. Đừng để tình cảm cá nhân làm mờ lý trí.

Thân ái!

 

[Trịnh Thành Trung]

Định không viết trong topic này nữa nhưng hôm nay có chút hứng thú lại viết lên để chia sẻ với bà con gần xa.

1. Mình đã giải được bài toán mình kể cho các bạn.

Cách làm: Trước khi đem tế bào vi khuẩn đi tách DNA, mình dùng đệm PBS rửa tế bào 2 lần (Thực ra, bạn có thể dùng nước cất để rửa vì bạn chuẩn bị thịt cái con vi khuẩn ấy nên cũng chẳng cần quan tâm đến ưu, nhược, đẳng trương làm gì). Sau đó đưa DNA này vào 'lò phản ứng', bật công tác máy, thế rồi mẫu nào cũng nhìn thấy band lên, thế mới tuyệt vời chứ!

2. Cám ơn rất nhiều từ lời gợi ý của Phạm Thủy Trang ? , so zi Cường vì đã hiểu nhầm ý bạn nhưng mình tham khảo trong cuốn PCR protocol, 2003 thì họ nói hàm lượng bacterial DNA có thể từ 100-500ng trong 1 phản ứng 100ul (cái thể tích này là quan trọng lắm đấy, kẻo một số bạn lại hay nhầm khi không đối chiếu 2 con số đó: Hàm lượng DNA và thể tích phản ứng).

3. Rất mong một bạn sinh viên yêu thích khoa giải thích hộ vì sao khi rửa tế bào vi khuẩn trước khi tách ADN thì hàm lượng ADN thu được cũng tăng và độ tinh sạch của ADN cũng tăng (giao động từ 1,82 đến 1,86). Các bước làm thí nghiệm giữa rửa và không rử tế bào như nhau, sử dụng cùng một loại hóa chất. ?:?: ?

Thank for reading this information!

 

[Lê Hồng Đức]

Rất mong một bạn sinh viên yêu thích khoa giải thích hộ vì sao khi rửa tế bào vi khuẩn trước khi tách ADN thì hàm lượng ADN thu được cũng tăng và độ tinh sạch của ADN cũng tăng (giao động từ 1,82 đến 1,86). Các bước làm thí nghiệm giữa rửa và không rử tế bào như nhau, sử dụng cùng một loại hóa chất.  :?:

Bạn Trung có thể cho biết thêm vi khuẩn của bạn là gì (E. coli ?), đang ở trong đệm/môi trường gì (trước khi li tâm) mà phải rửa? Kit tách DNA của bạn là gì, nếu bạn không dùng kit thì gồm những hóa chất gì?

Bạn Trung làm PCR trên vi khuẩn làm gì thế? Nếu để screening khi tạo dòng, mình có cách làm PCR thẳng trên khuẩn lạc luôn: pha sẵn hỗn hợp phản ứng PCR (để đá), dùng que tăm vô trùng bắt một (chút xíu) khuẩn lạc cắm vào tuýp ngoáy mấy cái, đậy nắp chạy liền. Nhớ kèm chứng âm và dương và kéo dài thời gian biến tính (94[sup:6ed72d0614]o[/sup:6ed72d0614]C) ban đầu thành 5 phút (ban đầu thôi nhé, không phải cả 30 chu kỳ đâu!)

 

[Trịnh Thành Trung]

Mình đang tách chiết ADN từ eubacteria theo phương pháp DNeasy tissue kit, Qiagen. Sau đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen mong muốn. Mình không hiểu sao kết quả PCR rất chán, lúc được, lúc không.

Em làm về phân loại các vi khuẩn (thuộc chi Burkhoderia và em cũng chưa biết được con những con này có sản sinh chất ức chế pư PCR hay không?) phân lập được từ trong đất Việt Nam. Trước khi tách ADN, vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch máu (blood agar). Trước đó, em lấy trực tiếp 1 khuẩn lạc rồi bỏ vào dung dịch ATL buffer của kit.

Bạn Trung làm PCR trên vi khuẩn làm gì thế? Nếu để screening khi tạo dòng, mình có cách làm PCR thẳng trên khuẩn lạc luôn: pha sẵn hỗn hợp phản ứng PCR (để đá), dùng que tăm vô trùng bắt một (chút xíu) khuẩn lạc cắm vào tuýp ngoáy mấy cái, đậy nắp chạy liền. Nhớ kèm chứng âm và dương và kéo dài thời gian biến tính (94oC) ban đầu thành 5 phút (ban đầu thôi nhé, không phải cả 30 chu kỳ đâu!)

Cám ơn rất nhiều từ lời gợi ý của anh. Dù sao, bây giờ em mới thấy được ích lợi khi tham gia diễn đàn (vì lúc trước, em vào đây chỉ nghĩ cách tấn công một số bác khác thôi dựa trên những suy nghĩ của em để làm tăng cao hơn nữa chất lượng của diễn đàn). Phương pháp anh gợi ý em cũng đã được nghe thoang thoảng nhưng chưa tìm được cái protocol cụ thể. Hôm nay gặp được anh, quả là vinh hạnh lớn trong đời em. Xin đa tạ, đa tạ...

Chắc tuần sau em bắt đầu thử phương pháp anh gợi ý. Tuy nhiên, anh cho em hỏi thêm một chút kinh nghiệm nữa: - Liệu ta có phải kéo dài cái thời gian nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch (lúc đó, nhiều tế bào vi khuẩn cũng đã đi vào Văn Điển, nó có thể để lại các đoạn AND free ở bên ngoài)

Cám ơn anh rất nhiều!

 

[Phạm Thủy Trang]

3. Rất mong một bạn sinh viên yêu thích khoa giải thích hộ vì sao khi rửa tế bào vi khuẩn trước khi tách ADN thì hàm lượng ADN thu được cũng tăng và độ tinh sạch của ADN cũng tăng (giao động từ 1,82 đến 1,86). Các bước làm thí nghiệm giữa rửa và không rử tế bào như nhau, sử dụng cùng một loại hóa chất. ?:?: ?

Em chưa biết rõ về tách ADN ở vi khuẩn nhưng nghĩ đơn giản là khi rửa vi khuẩn sẽ loại bỏ (hoặc giảm nồng độ) một số chất có ở môi trường ngoại bào (trong môi trường nuôi cấy) có thể ảnh hưởng tới hoạt động của các hóa chất trong quá trình tách chiết hoặc sau tách chiết. Các chất này có thể là thành phần của môi trường sử dụng hay do con vi khuẩn đấy tổng hợp rồi tiết ra ngoài.
Kô biết suy luận này có hợp lý không. Mong các anh chỉ giáo ạ.

 

[Dương Văn Cường]

Mình cũng không hiểu ý Trung về việc rửa vi khuẩn. Để tách DNA thì bao giờ cũng có bước ly tâm thu tế bào vi khuẩn mà? Sau bước này chỉ còn lại TB vi khuẩn, còn môi trường nuôi cấy là pha lỏng sẽ bị loại bỏ.