Bạn đã thiết kế cặp mồi PCR để khuếch đại trình tự quan tâm và bạn sẵn sàng cho việc đó. Nhưng trừ phi bạn có sự bổ sung không ngừng của khuôn mẫu, enzyme polymerase và máy chu trình nhiệt với chức năng gradient – mà không kể đến thời lượng thời gian hay lòng kiên nhẫn – bạn chắc chắn không muốn dành tuần kế tiếp để tìm ra các điều kiện hoàn hảo cho phản ứng PCR của bạn. Ở đây là một số mẹo để giúp bạn thực hiện nhanh hơn (mặc dù chức năng gradient khá là tiện dụng)
Nhiệt độ gắn mồi và nhiệt độ nóng chảy
Công ty mà bạn đặt cặp mồi oligo sẽ cung cấp thông tin nhiệt độ nóng chảy (Tm) trong tài liệu mà họ gửi kèm với oligo. Tuy nhiên, tôi nhận thấy rằng các công ty khác nhau ước lượng Tm cũng hơi khác nhau, phụ thuộc vào phép tính mà họ sử dụng. Công cụ OligoAnalyzer trên trang web IDT thực sự hữu ích khi xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu để thiết lập các chu kì PCR của bạn.Tuy nhiên, nếu bạn muốn bản thân làm điều đó hơn, thì đây là công thức:
Tm= 2(A+T) + 4(G+C)
Trong đó, A,T,G,X bằng với số lượng của mỗi bazơ nitơ này trong trình tự mồi.
Nhiệt độ nóng chảy chịu ảnh hưởng bởi nồng độ muối đệm , pH, và nồng độ mồi, nhưng tôi đã nhận thấy điều này không đáng lo ngại. Kiểm tra lại rằng bất kì cấu trúc bậc hai không mong muốn nào đều có nhiệt độ nóng chảy dưới nhiệt độ gắn mồi lí tưởng (Ta) (tối thiểu thấp hơn 10oC) đáng kể. Điều này sẽ ngăn chặn bản thân các oligo khỏi sự khuếch đại trong PCR. Công cụ OligoAnalyzez cũng sẽ kiểm tra sự có mặt bất kì cấu trúc bậc hai nào khi thiết kế các oligo.
Tôi khuyên rằng nhiệt độ gắn mồi nên được đặt dưới mức nhiệt độ nóng chảy thấp nhất của mồi là 3oC. Ví dụ, nếu mồi xuôi của bạn có Tm là 62oC và mồi ngược có Tm là 61oC, tôi đề xuất thực hiện với Ta là 58oC.
Nếu bạn đủ may mắn để truy cập vào một chu trình nhiệt với chức năng gradient và đủ lượng khuôn mẫu để cài đặt PCR nhân đôi hay nhân ba lần, tôi đề nghị thử nghiệm một khoảng nhiệt độ gắn mồi và đánh giá Ta nào cung cấp kết quả tốt nhất.
Sử dụng touchdown PCR
Một trong những mẹo ưa thích của tôi là phương pháp touchdown PCR, trong đó một vài chu kì phản ứng PCR ban đầu được đặt ở nhiệt độ gắn mồi cao hơn. Sau đó Ta sẽ được giảm 1-2oC qua mỗi chu kì. Tôi đã thành công với kĩ thuật này. Vậy kĩ thuật này trông như thế nào?
Sử dụng ví dụ ở trên với nhiệt độ nóng chảy là 62oC và 61oC, tôi sẽ cài đặt Ta ở hai chu kì đầu là 63oC, hai chu kì kế tiếp là 62oC và sau đó là 61oC, 60oC và 59oC với tổng cộng 10 chu kì. Tiếp theo, tôi sẽ thực hiện 25 chu kì tại 58oC. Lợi ích của kĩ thuật này là các chu kì đầu tiên sẽ rất nghiêm ngặt, vì vậy rất khó xảy ra sự khuếch đại không đặc hiệu. Do đó, khi nhiệt độ gắn mồi trở dễ chấp nhận hơn, sẽ có một bể các sản phẩm khuếch đại mong muốn của bạn để cạnh tranh với bất kì trình tự không đặc hiệu cho việc gắn các mồi của bạn.
Hãy đảm bảo chu trình nhiệt của bạn thay đổi nhiệt độ một cách chính xác và hiệu quả. Tôi đã học được điều đầu tiên là bao nhiêu thời gian có thể bị lãng phí trong sự cố gắng tối ưu hóa các phản ứng PCR trên một cỗ máy mà nó hoạt động không chính xác. Một tín hiệu về chu trình nhiệt của bạn có lẽ không hoạt động chính xác là phản ứng diễn ra lâu hơn hơn so với bình thường. Bạn có thể đảm bảo mọi thứ là đang hoạt động đơn giản bằng cách bao gồm một mẫu đối chứng với mỗi lần chạy (VD: mồi, khuôn, điều kiện đệm mà bạn xác nhận trước đó).
DNA khuôn
Sử dụng khuôn chất lương! Ngoài ra, sử dụng quá nhiều DNA sẽ làm giảm độ đặc hiệu phản ứng và làm tăng sự khuếch đại các sản phẩm không mong muốn. Bởi vì phản ứng PCR là rất nhạy, thử sử dụng mẫu DNA ít nhất có thể. Bắt đầu với không quá 1 ng mẫu DNA cho khuôn plasmid , 10-40 ng cho mẫu cDNA hoặc lên tới 1 ug đối với các mẫu DNA genome.
Thời gian kéo dài
Bạn đã bao giờ tự hỏi rằng ai là người tìm ra chu trình luân nhiệt mà tất cả chúng ta sử dụng. Trong khi số lần biến tính và hồi tính vẫn khá không đổi, thời gian kéo dài có thể thay đổi đáng kể dựa vào kích thước sản phẩm khuếch đại. Quy tắc chung là cho phép một thời gian kéo dài là 60s cho mỗi sản phẩm khuếch đại có kích thước 1 kb. Ví dụ, nếu bạn khuếch đại một đoạn 2 kb, bạn sẽ cài đặt thời gian kéo dài là 120s cho mỗi chu kì. Đối với các sản phẩm khuếch đại ngắn hơn, thì giảm thời gian kéo dài. Đối với sản phẩm khuếch đại 200 bp, thời gian kéo dài từ 15 đến 20s là đủ. Quá nhiều thời gian kéo dài có thể tạo ra các sản phảm không mong muốn.
Lựa chọn enzyme Polymearae
Enzyme Taq DNA Polymease được sử dụng phổ biến cho phản ứng PCR. Enzyme Pyrococcus furiosus (PFU) polymerase không những được sử dụng phổ biến cho PCR mà còn có tỉ lệ sai sót thấp hơn so với enzyme Taq polymerase. Tuy nhiên, các enzyme khác nhau hoạt động ít nhiều hiệu quả đối với các khuôn khác nhau. Ví dụ, nếu vùng khuôn quan tâm của bạn chứa hàm lượng G-C cao (trên 65%), thì enzyme Accuprime DNA polymerase giàu G-C từ Thermo Scientific có lẽ hoạt động tốt hơn đối với phản ứng PCR của bạn.
Các thành phần dung dịch đệm (buffer)
Khi bạn mua enzyme polymerase,sẽ có một loại đệm đã tối ưu với enzyme đi kèm theo. Sử dụng đệm theo như hướng dẫn của nhà sản xuất được xem là sự đặt cược tốt nhất cho bạn. Tuy nhiên, điều quan trọng đó là để hiểu các thành phần của đệm và sự đóng góp của chúng tới hiệu quả PCR. Hầu hết các đệm là một sự kết hợp đơn giản của muối- như KCl và Mg2Cl2 tại một điểm pH tối ưu.
Magie
Nồng độ magie có thể được thao tác để thay đổi hiệu quả và tính chính xác của phản ứng PCR. Đối với Taq DNA polymerase nồng độ magie tối ưu từ 1.5 đến 2 µM. Bởi vì các thành phần phản ứng và đệm có thể bắt giữ magie, vì thế điều cần thiết là tăng nồng độ magie. Khi biến đổi nồng độ này, cần có các sự điều chỉnh nhỏ (xấp xỉ sự bổ sung là 0.5 µM )
Mồi
Ai đó có thể đã dành cả ngày để bàn luận về “thiết kế tối ưu” cho mồi PCR (chiều dài, hàm lượng G-C, nhiệt độ nóng chảy, cấu trúc bậc hai,…). Tuy nhiên ở đây tôi muốn đề cập một cách đơn giản tầm quan trọng của việc tối ưu nồng độ mồi trong PCR. Nếu bạn thêm quá nhiều mồi, sẽ làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau. Như một quy luật chung, nồng độ mồi tổng số thường ở mức 1 uM. Để tăng độ đặc hiệu, có thể giảm xuống thấp ở mức 0.1 uM, tuy nhiên điều này có thể làm giảm hiệu suất PCR.
dNTP
Nồng độ của cac deoxynucleotides (dNTPs) có thể ảnh hưởng tới cả độ đặc hiệu và năng suất của PCR. Nồng độ dNTP quá cao sẽ làm giảm độ đặc hiệu, trong khi quá thấp sẽ làm giảm hiệu suất. Đối với muc đích của tôi, năng suất ít quan trọng hơn độ đăc hiệu,Vì vậy tôi sử dụng nồng độ dNTP 50 µM cho hầu hết các phản ứng. Tuy nhiên, bạn có thể tăng nồng độ lên tới 200µM để tăng hiệu suất.
Hi vọng những mẹo này sẽ giúp bạn tối ưu hóa phản ứng PCR nhanh hơn
Chúc may mắn!
Nguồn gốc bài viết: Biosizebio.com
Người dịch: Lê Thị Quỳnh Hoa
Biên tập: Sinhhocvietnam.com
