Tiến sĩ Tanuja Koppal thảo luận với các Tiến sĩ Emir Hodzic, Keith R. Jerome và Ruth trường Sedlak về hệ thống PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp – Polymerase chain reaction) kỹ thuật số.
Câu hỏi: Ông có sử dụng PCR cho ngành khoa học thú y hay không?
Hodzic: Cơ sở phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực (real-time PCR) của chúng tôi tại UC Davis là một trong những cơ sở PCR cốt lõi lâu đời nhất, đã tồn tại được gần 15 năm. Cơ sở này có hai bộ phận, một cho việc nghiên cứu và một cho việc chẩn đoán. Bộ phận nghiên cứu bao gồm các dịch vụ như tư vấn, hỗ trợ thiết kế thí nghiệm, thực hiện phân tích PCR và phân tích dữ liệu, phục vụ cho mọi người, cả trong lẫn ngoài trường. Tiếp theo, chúng tôi có một bộ phận chẩn đoán thú y, nơi chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh ở động vật nhỏ và lớn. Ở đó, chúng tôi nhận các mẫu từ các bác sĩ trong trường, cũng như từ ngoài tiểu bang và ở nước ngoài. Chúng tôi đã chỉ định gần 100 xét nghiệm PCR để chẩn đoán phân tử cho nhiều mầm bệnh bao gồm vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng lây nhiễm ở các động vật lớn và nhỏ. Chúng tôi có các bảng hiển thị hệ thống hô hấp, thần kinh và tiêu hóa để phát hiện các mầm bệnh trong chăn nuôi ngựa, mèo và chó, thuận tiện hơn so với làm xét nghiệm các mầm bệnh đơn.
Câu hỏi: Khía cạnh thách thức nhất của PCR mà ông đã thực hiện là gì?
Hodzic: Khía cạnh thách thức nhất là thiết kế các thử nghiệm cụ thể cho một tác nhân gây bệnh cụ thể. Các tác nhân gây bệnh như virus đã trải qua nhiều đột biến nên việc tìm kiếm tất cả các chủng khác nhau của các loài trong một thí nghiệm là rất khó. Đồng thời, tất cả các thử nghiệm của chúng tôi đều có hiệu quả cao, thường từ 95 đến 100 phần trăm. Việc tìm kiếm các thao tác thích hợp cho một xét nghiệm có thể là một thử thách, và sau đó là việc diễn giải dữ liệu. PCR là một kỹ thuật rất nhạy cảm, nhưng đôi khi, các kết quả cần phải được xác nhận bằng việc sử dụng một số kỹ thuật khác.
Câu hỏi: Làm thế nào để ông giải quyết vấn đề xung quanh sự ô nhiễm và độ tin cậy của dữ liệu?
Hodzic: Chúng tôi có những tiêu chuẩn rất cao về kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng. Mọi bước đi, từ việc nhận mẫu để xử lý, tách chiết oligonucleotide để thực hiện PCR và cuối cùng là phân tích dữ liệu, tất cả đều được kiểm soát tốt. Điều này đòi hỏi thời gian cùng với nỗ lực, và chắc chắn là không rẻ chút nào. Chúng tôi thiết lập mọi thứ sao cho không có chỗ cho ô nhiễm. Một phần của phòng thí nghiệm được thiết lập để nhận mẫu, trong khi việc khai thác mẫu và PCR lại được thực hiện trong một phòng thí nghiệm khác. Tất cả các thuốc thử, sơn lót, thăm dò, và hỗn hợp của chúng tôi đều được lưu trữ trong một căn phòng sạch sẽ, và những người di chuyển giữa các phòng thí nghiệm phải tuân theo các quy trình để đảm bảo không có ô nhiễm. Chúng tôi có quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOPs – Standard operating procedures) đối với mỗi bước duy nhất và đối với các loại mẫu khác nhau mà chúng tôi phân tích. Chúng tôi thường xuyên kiểm tra thiết bị và các bề mặt mà chúng tôi làm việc để đảm bảo không có ô nhiễm. Đó là cách duy nhất để chúng tôi có thể đảm bảo về dữ liệu của chúng tôi.
Câu hỏi: Đối với PCR thì vấn đề đào tạo quan trọng như thế nào?
Hodzic: Vấn đề đào tạo là rất quan trọng và các nhân viên của chúng tôi phải trải qua một vài tháng đào tạo. Có rất nhiều hội thảo và các khóa học về phương pháp định lượng PCR (qPCR) được tổ chức trong khuôn viên trường. Việc thiết lập real-time qPCR rất dễ dàng, nhưng từng bước và mọi bước đi cùng lại vô cùng quan trọng. Khi chúng tôi gặp gỡ với khách hàng của mình, chúng tôi luôn dành thời gian thảo luận làm thế nào để thiết kế các thí nghiệm PCR, những loại mẫu nào cần được sử dụng và làm thế nào để thu thập cũng như lưu trữ chúng. Việc xử lý mẫu, việc khai thác oligonucleotide, kiểm soát chất lượng – mọi thứ cần được đánh giá một cách cẩn thận. Tất cả nhân viên của chúng tôi đều được đào tạo trong việc thực hiện các bước PCR và làm thế nào để khắc phục sự cố nếu có vấn đề xảy ra. Tuy nhiên, việc trao đổi thông tin và thảo luận với các đồng nghiệp luôn rất hữu ích dù cho có thông thạo đến đâu.
Câu hỏi: Có phải đã có rất nhiều thay đổi trong PCR những năm gần đây? Ông đã cân nhắc đến việc sử dụng PCR kỹ thuật số chưa?
Hodzic: Thiết bị kỹ thuật cho PCR không thay đổi nhiều trong thập kỷ qua. Cũng đã có những công nghệ mới như PCR kỹ thuật số đã được giới thiệu, nhưng chúng tôi chưa thấy PCR kỹ thuật số được sử dụng trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. PCR kỹ thuật số không có khả năng để phân tích các tác nhân gây bệnh phức tạp từ những mẫu tương tự hoặc để quan sát 30 đến 40 mẫu cùng một lúc. Kỹ thuật này đòi hỏi lao động và phù hợp hơn cho mục đích nghiên cứu, không phải cho chẩn đoán. Mặc dù tôi không cho rằng PCR thời gian thực sẽ thay đổi nhiều trong vài năm tới, nhưng các hệ thống thăm dò đang được sử dụng sẽ phát triển, và PCR chắc chắn sẽ được sử dụng nhiều hơn cho các ứng dụng chẩn đoán.
Câu hỏi: Ông đã sử dụng PCR kỹ thuật số trong phòng thí nghiệm của mình bao lâu rồi?
Sedlak: Chúng tôi đã sử dụng thiết bị PCR kỹ thuật số dạng giọt từ một vài năm nay. Chúng tôi bắt đầu sử dụng thiết bị này trong phòng thí nghiệm lâm sàng để xem nó có lợi cho việc chăm sóc lâm sàng hay không và sau đó bắt đầu sử dụng cho việc nghiên cứu của chúng tôi, đặc biệt là đối với định lượng tải lượng virus và chỉnh sửa gen, quan sát các đột biến được giới thiệu bởi meganucleases hoặc các hệ thống CRISPR/Cas. Những gì chúng tôi thấy được là PCR kỹ thuật số hoạt động tốt hơn đối với các ứng dụng mà bạn cần đo lường chính xác.
Câu hỏi: Các ứng dụng nào bảo đảm việc sử dụng PCR kỹ thuật số?
Jerome: PCR kỹ thuật số đang tạo điều kiện cho chúng tôi trong việc phát triển cách chữa bệnh nhiễm trùng mãn tính do virus như HIV, viêm gan B, và herpes. Chúng tôi đang phát triển một số endonuclease xác định, trong đó có hệ thống protein CRISPR/Cas. Những nucleases có thể giúp tìm ra DNA của virus trong tế bào và gây ra những đột biến cụ thể có thể gây chết các virus. Đây là một công nghệ cực kỳ mạnh mẽ và đầy hứa hẹn. Đối với công việc này, chúng tôi cần hai phép đo quan trọng. Đầu tiên, chúng tôi cần phải tìm ra chính xác có bao nhiêu virus tồn tại trong các mô hình thử nghiệm của chúng tôi, chúng tôi có thể gây ảnh hưởng đến loại virus này bao nhiêu, và sau đó có bao nhiêu virus bị phá hủy. Chúng tôi cần một công nghệ rất chính xác để đo lường. qPCR thực sự có khả năng tốt nhất trong việc phát hiện sự khác biệt ở quy mô lớn và không thể phân biệt một vài thay đổi ở cấp độ phần trăm. Mặt khác, PCR kỹ thuật số cung cấp độ chính xác tinh tế để đánh giá tải lượng virus ở mức độ phần trăm. Thứ hai, chúng tôi có thể sử dụng PCR kỹ thuật số để giám sát những đột biến cụ thể mà chúng tôi gây ra trong các virus để xác định chính xác các phần chúng tôi muốn tiêu diệt. Chúng tôi có thể thực hiện PCR trên các alen cụ thể hoặc trên alen đối xứng bằng cách sử dụng qPCR, nhưng với công nghệ kỹ thuật số, chúng tôi có thể tìm thấy một tỷ lệ rất nhỏ các đột biến trong nền tảng của các loại virus chưa xác định. Khi chúng tôi có được hiệu quả cao hơn, chúng tôi có thể có được con số rất chính xác về tỷ lệ phần trăm của virus đã được biến đổi. Ứng dụng cụ thể này thực sự mang đến sự chính xác lớn mà PCR kỹ thuật số cung cấp so với qPCR.
Hỏi: Những hạn chế của việc sử dụng kỹ thuật số PCR là gì?
Jerome: Những hạn chế khi sử dụng kỹ thuật số PCR là khá ít. Trong một số trường hợp, nó thường dễ bỏ qua các loại mẫu khác nhau hơn so với qPCR. Nó kháng lại ức chế mẫu. Một khi bạn đã thiết kế tốt một khảo nghiệm qPCR, thì sẽ chỉ cần thực hiện rất ít xác nhận bổ sung để chuyển đổi nó sang kỹ thuật số PCR. Do đó, rào cản khi thực hiện PCR kỹ thuật số ở một phòng thí nghiệm đã thực hiện qPCR cũng khá là thấp. Hạn chế chính trong một số các hệ thống PCR kỹ thuật số thế hệ đầu tiên là thông lượng tổng thấp hơn so với hệ thống qPCR cấp lâm sàng sử dụng đĩa 96 giếng. PCR kỹ thuật số cần sử dụng các thao tác tay lâu hơn, nhưng đối với các ứng dụng nghiên cứu thì đây không phải là vấn đề, bởi vì chúng tôi không cần làm hàng ngàn mẫu.
Sedlak: Thời gian cần thiết để thực hiện các thao tác bằng tay phụ thuộc vào cách phòng thí nghiệm qPCR của bạn được thiết lập. Phòng thí nghiệm lâm sàng của chúng tôi đã được thiết kế rất hiệu quả để thực hiện qPCR kể từ khi chúng tôi làm thử nghiệm lâm sàng với số lượng lớn. Do đó, đối với phòng thí nghiệm của chúng tôi, các công cụ PCR kỹ thuật số được thiết lập để thực hiện với đĩa 96 giếng cũng mất nhiều thời gian hơn qPCR khoảng ba lần. Nhược điểm của PCR kỹ thuật số là nó không phải là một phép đo thời gian thực như qPCR. Nó là một phép đo điểm cuối, và cần thêm một vài giờ để thí nghiệm tổng thể. Các thiết lập ban đầu của các phản ứng mất thời gian nhiều hơn khoảng 45 phút so với qPCR. Tuy nhiên, đã có sẵn thiết bị đo đạc robot, đây cũng là một lựa chọn cho máy tạo giọt nhằm làm giảm thời gian thiết lập, và phòng thí nghiệm nghiên cứu của chúng tôi cũng sử dụng nó khi tạo ra các tấm phản ứng. Tương tự như qPCR, các kết quả cho ra từ một công cụ kỹ thuật số cũng sẽ chỉ tốt bằng các xét nghiệm mà bạn đã phát triển. Tuy nhiên, trong PCR kỹ thuật số, nếu xét nghiệm của bạn không hoạt động đúng thì sẽ thể hiện ra rất rõ ràng, và đây là một điều tốt bởi vì sau đó bạn có thể tối ưu hóa các xét nghiệm hơn. Bạn cũng có thể thấy rõ các vấn đề có ảnh hưởng khi sử dụng PCR kỹ thuật số mà thường bị che giấu khi sử dụng qPCR.
Hỏi: Làm thế nào để so sánh về chi phí giữa PCR truyền thống và PCR kỹ thuật số?
Sedlak: Các chi phí tiêu dùng và các thuốc thử vào khoảng $3 đến $5 mỗi giếng cho một khảo nghiệm kỹ thuật số tùy thuộc vào thông lượng của bạn, không tốn hơn nhiều so với qPCR. Chi phí không phải là một cản trở, và các loại thông tin mà bạn nhận được là thứ bạn không thể có được khi sử dụng qPCR.
Jerome: PCR kỹ thuật số có những khía cạnh rõ ràng vượt trội hơn qPCR, nhưng đối với nhiều ứng dụng những lợi thế này lại không ăn thua. Chẳng hạn như tải lượng virus lâm sàng thường xuyên của chúng tôi vẫn được đo lường bằng cách sử qPCR, cách này cung cấp thông lượng cao và đơn giản. Những con số mà bạn nhận được sẽ chính xác hơn so với PCR kỹ thuật số, nhưng trong những nghiên cứu vừa và nhỏ, chúng tôi không thể chứng minh ưu thế về việc chăm sóc bệnh nhân hay quản lý. Vì vậy, người ta cần phải cẩn thận lựa chọn các ứng dụng mà những ưu điểm của PCR kỹ thuật số có thể thể hiện tốt hơn trong nghiên cứu hoặc chăm sóc bệnh nhân.
Hỏi: Ông/bà chọn hệ thống PCR kỹ thuật số để sử dụng như thế nào?
Sedlak: Đối với chúng tôi, các dụng cụ kỹ thuật số giọt cung cấp thông lượng tốt hơn và ít tiêu hao chi phí hơn khi so sánh với các công cụ dựa trên chip. Các hệ thống dựa trên chip có ít phân vùng hơn nhưng tiêu hao tốn kém hơn cho mỗi phân vùng. Tuy nhiên, các hệ thống dựa trên chip đôi khi có thể thực hiện thí nghiệm PCR thời gian thực và có thể cho ra kết quả kỹ thuật số ở cuối. Chúng tôi không có nhu cầu cho kết quả thời gian thực trong các thí nghiệm PCR kỹ thuật số của chúng tôi, nhưng nếu đó là điều bạn cần, thì sử dụng một định dạng dựa trên chip cung cấp các tùy chọn sẽ tốt hơn.
Jerome: Các lựa chọn khác được cung cấp bởi phương pháp tiếp cận truyền thông dựa trên chip hoặc chất rắn rất hấp dẫn trong lĩnh vực nghiên cứu, vì người ta có thể lấy lại các giếng tích cực trong phản ứng và trình tự các axit nucleic trong mỗi giếng sau đó. Hệ thống giọt không cho phép chúng tôi nắm bắt những giọt tích cực và trình tự riêng rẽ của chúng.
Hỏi: Những khiếm khuyết nào trong PCR kỹ thuật số mà ông/bà muốn cải thiện?
Sedlak: Cải tiến về mặt thông lượng và về thời gian thực hiện các thao tác tay cũng như giảm thiểu các biến cố xảy ra bởi các bước thực thiện bằng tay khác nhau chắc chắn là các lĩnh vực có thể được cải thiện trong PCR kỹ thuật số.
Jerome: Tôi hy vọng rằng các nhà sản xuất sẽ tăng số lượng kênh có thể phân tích được bằng PCR kỹ thuật số giọt. Ruth đã dành rất nhiều thời gian phát triển các phương pháp ghép thông minh sử dụng việc gắn nhãn khác biệt, nhưng hiện tại chúng tôi chỉ có hai màu sắc có sẵn. Do đó, ghép kênh bậc cao cho chất phân tích là rất khó khăn khi sử dụng PCR kỹ thuật số vào lúc này. Đối với thử nghiệm ghép cho nhiều virus, việc sử dụng nhiều kênh và màu sắc khác nhau sẽ rất hữu ích.
Hỏi: Ông/bà có lời khuyên nào dành cho những người đang có ý định đầu tư vào PCR kỹ thuật số không?
Jerome: Tôi sẽ khuyên mọi người phải cân nhắc thật kỹ về các ứng dụng của họ và xem những ưu điểm của PCR kỹ thuật số có giá trị cho ứng dụng đó hay không. Nếu độ chính xác là quan trọng nhất thì PCR kỹ thuật số là lựa chọn tuyệt vời. Nếu bạn cần tìm và định lượng dữ kiện hiếm trong nền tảng của các dữ kiện tự nhiên thì kỹ thuật số cũng là lựa chọn rất tốt. Tuy nhiên, nếu bạn chỉ muốn đo lường có bao nhiêu chất phân tích đang hiển thị thì qPCR sẽ dễ dàng hơn trong sử dụng và cung cấp thông lượng. Kỹ thuật số sẽ làm tăng thêm phức tạp, và người ta cần phải suy nghĩ kỹ càng về việc nó có thực sự cần thiết hay không.
Emir Hodzic, Tiến sĩ, Bác sĩ Thú y tốt nghiệp ngành thú y tại Đại học Sarajevo, Bosnia và Herzegovina, ông đã có bằng thạc sĩ và tiến sĩ. Sau khi hoàn thành nghiên cứu sinh sau tiến sĩ tại Đại học Yale, ông chuyển đến Trung tâm Y học so sánh tại Đại học California, Davis. Từ năm 2005, ông đảm nhiệm vị trí Giám đốc của Sở Nghiên cứu PCR thời gian thực và Chẩn đoán lõi.
Tiến sĩ Keith R. Jerome là người đứng đầu Bộ phận Virus học tại Khoa Y học Thực nghiệm, Đại học Washington và là thành viên của chương trình kết hợp về khoa học bệnh truyền nhiễm /virus học tại Trung tâm Nghiên cứu Ung thư Fred Hutchinson. Ông đã nhận được bằng Bác sĩ Y khoa và Tiến sĩ của Đại học Duke. Ông đã hoàn thành đào tạo sau đại học về Y học trong phòng thí nghiệm và virus học tại Đại học Washington.
Tiến sĩ Ruth Hall Sedlak là một nhà khoa học về nghiên cứu virus học phân tử trong phòng thí nghiệm tại Khoa Y học Thực nghiệm của Đại học Washington. Bà đã giành được bằng Tiến sĩ về vi sinh và công nghệ nano tại Đại học Washington vào năm 2011. Sau khi hoàn thành đào tạo sau tiến sĩ với Tiến sĩ Keith Jerome về chẩn đoán virus herpes và các ứng dụng của PCR kỹ thuật số, bà tiếp tục làm việc trong phòng thí nghiệm với cương vị là một nhà khoa học phát triển chẩn đoán.
Theo VinaLab
