Làm tế bào khả biến thế nào cho tốt?

[Dương Văn Cường]

Một trong những nỗi hồi hộp lớn nhất khi làm Sinh học phân tử là khi biến nạp. Buổi sáng hí hửng lên phòng thí nghiệm, mở cái đĩa biến nạp ra thì hỡi ôi, chả có chú khuẩn lạc nào xuất hiện cả. Thế là toi cơm.

Một trong những nguyên nhân chính là tế bào khả biến làm không tốt. Vì vậy, tôi mở chủ đề này để xem bà con ai có protocol cũng như kinh nghiệm làm tế bào khả biến ngon lành thì cùng trao đổi. Tế bào loại nào cũng được.

 

[Trần Hoàng Dũng]

tui thay tui bien nap de lam ma; lam ca 50 lan deu thanh cong ca 50 lan ha, tu dien bien nap cho den hoa bien nap, chua thay rac roi gi.

 

[Dương Văn Cường]

tui thay tui bien nap de lam ma; lam ca 50 lan deu thanh cong ca 50 lan ha, tu dien bien nap cho den hoa bien nap, chua thay rac roi gi.

Trùi, vậy hả ?? Sao em biến nạp phập phù thế. Đặc biệt biến nạp các plasmid tái tổ hợp rất khó.

Vậy chắc anh có protocol ngon lành rùi. Thử post lên cái protocol làm tế bào E.coli DH5alpha hay BL21 em tham khảo cái ?

 

[Bùi Thị Kim Lý]

Em cũng muốn học hỏi cái protocol ngon lành đó lắm, chứ protocol của em làm hoài mà cứ ì ra đó, chẳng có con khuẩn nào mọc cả, bùn thiu hà, nếu được anh cho em xem thử protocol của anh nhé!!!

 

[Lê Hồng Đức]

Biến nạp phụ thuộc rất nhiều vào tế bào có khả biến không. Nếu bạn dùng chủng thông dụng như DH5a, TG1 hay BL21 (DE3) thì thường không đổ tại tế bào được. Tuy nhiên, mỗi mẻ tế bào khả biến có tính khả biến khác nhau, ngay cả khi bạn làm y hệt quy trình, do vậy cần kiểm tra mỗi mẻ tế bào với 1 chứng dương (là plasmid không tái tổ hợp).

Gene tái tổ hợp trên plasmid cũng có thể ảnh hưởng đến kết quả biến nạp. Nhiều gene gây li giải tế bào, nhất là các gene mã hóa cho protein xuyên màng. Một số gene khác có độc tính với tế bào chủ, hoặc ức chế các quá trình sinh trưởng khác của tế bào chủ nên tế bào dù khả biến cũng không nhân lên được (do vậy không có chú khuẩn lạc nào sàng hôm sau).

Gợi ý nhỏ: Đừng vứt đĩa biến nạp ngay buổi sáng hôm đó. Để thêm 1 ngày nữa xem sao, vì có khi qua đêm ở 37[sup:c323d8bf24]o[/sup:c323d8bf24]C chưa đủ để tế bào phục hồi sau shock nhiệt và tạo khuẩn lạc. Nếu có khuẩn lạc sau 2 ngày và bạn muốn bắt, chú ý đừng bắt nhầm khuẩn lạc nhiễm. Chúc may mắn.

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Tế bào khả biến phòng em làm đi làm lại ba lần nay đều bị nhiễm. Test trên ampicilin mọc tứ tung. Mà tất cả các khâu, đồ dùng đều khử trùng rất kỹ, không hiểu bị nhiễm từ đâu vậy? Chỉ có hóa chất: Cacl2, glycol và kháng sinh sau khi pha là không đem khử trùng thôi. Bác nào có kinh nghiệm để làm không bị nhiễm không?
Còn nữa, trường hợp mà sau hai, ba, thậm chí bốn ngày nuôi 37 độ mới mọc lên một hai chú khuẩn lạc thì giải thích làm sao ạ, nếu đã có gen kháng kháng sinh, thừa thãi dinh dưỡng thì nó phải lên ngay từ ngày đầu nuôi chứ. Liệu có nên bỏ thời gian check lại cái khuẩn lạc đó không?
Topic này mở ra lâu rồi, chắc các bác làm lâu có nhiều kinh nghiệm rồi

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Tế bào khả biến phòng em làm đi làm lại ba lần nay đều bị nhiễm. Test trên ampicilin mọc tứ tung. Mà tất cả các khâu, đồ dùng đều khử trùng rất kỹ, không hiểu bị nhiễm từ đâu vậy? Chỉ có hóa chất: Cacl2, glycol và kháng sinh sau khi pha là không đem khử trùng thôi. Bác nào có kinh nghiệm để làm không bị nhiễm không?
Còn nữa, trường hợp mà sau hai, ba, thậm chí bốn ngày nuôi 37 độ mới mọc lên một hai chú khuẩn lạc thì giải thích làm sao ạ, nếu đã có gen kháng kháng sinh, thừa thãi dinh dưỡng thì nó phải lên ngay từ ngày đầu nuôi chứ. Liệu có nên bỏ thời gian check lại cái khuẩn lạc đó không?
Topic này mở ra lâu rồi, chắc các bác làm lâu có nhiều kinh nghiệm rồi

CaCl2 và kháng sinh sau khi pha thì bạn phải lọc để vô trùng. Glycerol bạn cũng nên khử trùng.

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Lọc khử trùng là thế nào ạ, ptn chỉ có máy hấp thanh trùng 121 độ thôi. Glycerol khi pha hóa chất trộn lẫn với Cacl2 luôn nên không dùng hai biện pháp khử trùng khác nhau được, liệu em bỏ tất vào hấp thanh trùng được không ạ.

 

[cfareast]

Lọc khử trùng là thế nào ạ, ptn chỉ có máy hấp thanh trùng 121 độ thôi. Glycerol khi pha hóa chất trộn lẫn với Cacl2 luôn nên không dùng hai biện pháp khử trùng khác nhau được, liệu em bỏ tất vào hấp thanh trùng được không ạ.

Lọc khử trùng là dùng màng lọc lỗ 0,25-0.4ul, không phải dùng nhiệt (sẽ làm biến chất 1 số chất).

Tế bào mang ra làm khả biến, phải đạt tiêu chuẩn rồi mới tính đến transform.
Ít nhất phải đạt:

Kích thước đều, khi cấy LB 1 đêm là mọc tốt, đến chiều khuẩn lạc phải to đùng.
Mẫn cảm với kháng sinh.

Phải đúng là con E.coli (hoặc VK cần quan tâm).
Khả biến với các plasmid đem control test.

Trường hợp mọc lung tung trên môi trường Amp, hay vài ngay sau mới mọc, hoặc mọc phập phù.... Thì tốt hơn hết là vứt sọt rác, vì đã bị nhiễm hoặc tế bào bị hỏng lung tung!

Cái việc transform hay làm tế bào khả biến này rất đơn giản! Nhưng phải biết ý nghĩa từng bước!

Bạn Nhung làm bị nhiễm, đơn giản là chủng gốc khả biến bị nhiễm, hoặc cái môi trường LB đã bị nhiễm sẵn... Còn hóa chất như CaCl2 hay ampicillin, glycerol nếu ko khử trùng, thì cũng ko sao...vì nếu bị nhiễm, thì nồng độ rất nhỏ, ko ảnh hưởng đến cục diện.

 

[truong369]

CaCl2, MgCl2, glycerol lab em hấp 121oC, 20 phút luôn. Làm vẫn ra ào ào. Làm xong giữ lạnh sâu, -20oC hoặc -80oC. Nhưng tế bào khả nạp làm lâu quá cung quăng, hok dám xài.

 

[Nguyễn Thy Ngọc]

Theo cái bề dày kinh nghiệm nghiên cứu khoa học mỏng dính của em mà nói thì quá trình biến nạp thạnh bại là ở đoạn ligate gen của mình vào vector có OK hay không (nhất là mấy cái TA cloning vector)... Không biết có đúng hay không ... hè hè. Chứ tế bào khả biến thì em làm lần nào cũng tương đối OK (chắc tại do may mắn) ^^

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Còn tùy mục đích biến nạp. Ví dụ subcloning, hoặc làm library thì nói chung yêu cầu về efficiency phải cao hơn là kiểu clone TA.
Hoặc với những trường hợp insert lớn thì yếu tố efficiency cũng quan trọng.
Nếu mọi hóa chất đều chuẩn, giống chuẩn thì việc làm đều tay là bình thường

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Viết bài trả lời để khẳng định nguyên nhân là do không khử trùng hóa chất. Cacl2 và glycerol đã được bỏ vào nồi hấp thanh trùng và sau đó không còn hiện tượng tế bào khả biến bị nhiêm nữa. Cảm ơn bác Hưng, Trường và bác Lương nhé