Làm tan lại những protein bị biểu hiện ở inclusion bodies

[Dương Văn Cường]

Làm tan lại những protein bị biểu hiện ở inclus

Thông thường sau khi biểu hiện một gen chúng ta thu được protein ở dạng hòa tan (soluble) hoặc không hòa tan (inclusion bodies). Rất nhiều các protein biểu hiện trong E.coli ở dạng không hòa tan. Giữa hai dạng này có nhiều điểm khác nhau.

Tôi muốn hỏi có anh, chị nào đã có kinh nghiệm trong việc hòa tan protein dạng inclusion body thành protein hòa tan.

Tôi rất quan tâm đến việc này. Đầu tiên tôi cần biết có anh, chị nào đã làm thành công, sau đó tôi xin hỏi / trao đổi những vấn đề kỹ thuật cụ thể.

Xin cảm ơn!

 

[Lê Tiến Dũng]

Theo mình trước hết bạn nên thay đổi các điều kiện biểu hiện để được protein hòa tan trước khi có tinh sạch protein ở dạng inclusion body. Những điều kiện đó có thể là:

- Induction temp
- OD600 ở thời điểm induction
- Fuse gene của bạn với một gene khác (NusA, GST, etc)
..

Còn tinh sạch protein ở dạng inclusion body rồi refolding thì có nhiều KIT bán sẵn trên thị trường nhưng hiệu quả KHÔNG bao giờ bằng với protein tinh sạch ở dạng tự nhiên. Bạn không thể re-folding hoàn toàn được.

 

[Lê Hồng Đức]

Protein bị đóng gói trong inclusion body do:
- tế bào chủ không gấp được protein đúng cách
- protein bị sản xuất quá thừa và đe dọa quá trình sinh trưởng bình thường của tế bào chủ

Để giảm tình trạng trên, bạn có thể thử:
- kích thích biểu hiện muộn hơn (khi OD[sub:24069a0252]600nm[/sub:24069a0252] cao, khoảng 1-1.2) và gặt nhanh (1-2 h sau kích ứng)
- kích thích biểu hiện ở nhiệt độ thấp (25-30[sup:24069a0252]o[/sup:24069a0252]C)
- giảm 10X nồng độ chất kích thích (IPTG?)

Đối với inclusion body, bạn có thể phá vỡ tế bào chủ bằng mọi cách, đông tan thoải mái, dùng đệm có SDS, siêu âm v.v... mình đảm bảo bạn không phá vỡ được inclusion body (nên không sợ mất gì đâu).

Sau khi ly tâm và rửa nhiều lần để loại bỏ các protein tan được và các mảnh vụn tế bào, bạn sẽ có 1 cục cặn trong suốt, hơi vàng, đó là inclusion body của bạn.

Protein trong inclusion body thường rất tinh khiết và thậm chí không cần đến sắc ký ái lực. Có điều nó không tan. Inclusion body có thể bị làm tan bằng urea hoặc guanidine nồng độ cao (6-8 M). Vấn đề là protein lúc này lại bị biến tính và làm sao gấp nó lại cho đúng.

Gấp protein có thể được thực hiện bằng thẩm tích (đệm PBS thể tích 50-100 lần thể tích protein, giảm rất từ từ nồng độ urea/guanidine, có thể hỗ trợ protein với L-alanine 1 M trong đệm thẩm tích).

Chúc bạn may mắn.

 

[Nguyễn Viết Dũng]

Tôi cũng từng gặp rắc rối với sự cố trên khi biểu hiện protein, có nhiều cách khắc phục như mọi người đã nêu.

Để giảm tình trạng trên, bạn có thể thử:
- kích thích biểu hiện muộn hơn (khi OD600nm cao, khoảng 1-1.2) và gặt nhanh (1-2 h sau kích ứng)
- kích thích biểu hiện ở nhiệt độ thấp (25-30oC)
- giảm 10X nồng độ chất kích thích (IPTG?)

Đối với vi khuẩn Ecoli, tôi đã từng biễu hiện ở nhiện độ 16oC và kết quả biểu hiện có sự cải thiện đáng kể so với biểu hiện ở 37oC

Tôi xin góp thêm một cách khác, rất đơn giản nhất nhưng cũng thường mang lai hiệu quả dễ thấy: Đổi chủng vi sinh vật ?biểu hiện.

Ngoài ra còn một cách phức tạp hơn, nếu bạn có thể gắn thêm một leader peptide vào protein của bạn thì nó sẽ giúp cho protein của bạn được chuyển ra ngoài tế bào chất (ra môi trường nuôi cấy hoặc khoảng không gian của vách tế bào). Trong trường họp này sự khác biệt về thế oxy hóa khử có thể giúp protein của bạn "correct folding"

Theo tôi, nếu bạn gặp sự cố protein tái tổ hợp không thể hòa tan thì bạn nên chọn một phương án biểu hiện khác sao cho protein mong muốn được biểu hiện và hòa tan một cách tự nhiên hơn là tái hòa tan trong các điều kiện nhân tạo

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Theo em được biết thì khi mình denature protein và sau đó refolding lại thì không thể refolding được hết protein. Vậy thì xác suất protein có thể refolding lại là bao nhiêu? Với lại, trong trường hợp này, mình rất khó định lượng protein vì ? trong dịch chứa hỗn hợp 2 protein denature protein và nature protein (sau khi đã refolding), đúng không anh chị?
Cái em quan tâm là định lượng protein sau khi refolding vì em cần biết lượng protein là bao nhiêu để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo (như cell assay). không biết có cách nào định lượng chính xác protein của mình hoặc có thể loại bỏ những protein không được refolding không? Mong nhận được sự tư vấn của các anh chị.
Em cám ơn.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đo nồng độ protein khi nó đang unfolded.
Mà protein refold rồi không tan nữa thì lấy như thế nào ra khỏi dialysis cassette nhỉ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

đọc trên molecular biology forum cũng thấy có mấy chú hỏi về refolding & inclusion bodies đấy. Bạn thử vào hỏi vấn đề của mình xem.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Theo em được biết thì khi mình denature protein và sau đó refolding lại thì không thể refolding được hết protein. Vậy thì xác suất protein có thể refolding lại là bao nhiêu? Với lại, trong trường hợp này, mình rất khó định lượng protein vì   trong dịch chứa hỗn hợp 2 protein denature protein và nature protein (sau khi đã refolding), đúng không anh chị?
Cái em quan tâm là định lượng protein sau khi refolding vì em cần biết lượng protein là bao nhiêu để sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo (như cell assay). không biết có cách nào định lượng chính xác protein của mình hoặc có thể loại bỏ những protein không được refolding không? Mong nhận được sự tư vấn của các anh chị.
Em cám ơn.

Protein bị denature thì ko tan trong đệm không chứa ure. Do đó, khi refolding nghĩa là thay thế dần đệm chứa ure = các đệm phosphate hoặc Tris thông thường. Có nhiều kit refolding bán sẵn, hiệu suất của nó phụ thuộc vào từng protein cụ thể.

Các phân biệt thằng protein denature và folded dựa vào tính tan trong đệm, ly tâm thông thường là loại thằng denature ra rồi. Do đó, chỉ việc định lượng protein trong supernatant thì chính là protein đã folded. Tuy nhiên, trong số protein đã refolded có 1 lượng nhất định protein ko fold đúng cách, nghĩa là ko có hoạt tính sinh học. Do đó, phải dựa vào các đặc tính sinh học của chính protein đối tượng để làm các bioassay xác định tỷ phần protein có hoạt tính trong toàn bộ dịch sản phẩm.

Xem thêm

Tạo hình cấu trúc protein

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Đối với inclusion body, bạn có thể phá vỡ tế bào chủ bằng mọi cách, đông tan thoải mái, dùng đệm có SDS, siêu âm v.v... mình đảm bảo bạn không phá vỡ được inclusion body (nên không sợ mất gì đâu).

Sau khi ly tâm và rửa nhiều lần để loại bỏ các protein tan được và các mảnh vụn tế bào, bạn sẽ có 1 cục cặn trong suốt, hơi vàng, đó là inclusion body của bạn.

Protein trong inclusion body thường rất tinh khiết và thậm chí không cần đến sắc ký ái lực. Có điều nó không tan. Inclusion body có thể bị làm tan bằng urea hoặc guanidine nồng độ cao (6-8 M). Vấn đề là protein lúc này lại bị biến tính và làm sao gấp nó lại cho đúng.

Chúc bạn may mắn.

Anh Đức ơi, em làm theo protocol như sau:
Resuspend the cell pellet from 2 litres of culture in 30ml 1x PBS and sonicate on
ice to lyse the cells.
2. Pellet crude inclusion bodies at 12000g for 30 minutes and discard the
supernatant.
3. Resuspend the pellet in ~30ml Triton wash solution (0.5% Triton X100, 50mM
Tris-HCl pH8, 100mM NaCl and 0.1% sodium azide) using a homogeniser to
fully grind up the pellet.
4. Pellet inclusion bodies at 25000g for 10 minutes.
5. Repeat this wash 4 or 5 times - the pellet actually slightly whiter the more washes
that are performed.
6. Perform one final wash mainly to remove any remaining Triton. To achieve this,
resuspend using the homogeniser again in 50mM Tris pH8, 100mM NaCl and
then spin at 25000g for 10 minutes.
It's a good idea to do this thoroughly because the cleaner the inclusion body prep the
better the results in the refold and subsequent purification.
7. Dissolve the purified inclusion bodies in 6M Guanidine HCl, 550 mM Tris pH8,
100mM NaCl. 10mM EDTA and 10 mM DTT. Break up the pellet a bit using a
pipette tip and then preferably leave at 4°C on a shaker/rocker for at least a few
hours to fully dissolve.
The amount of GnHCl buffer needed will vary but start with 3 ml and add a little more if
necessary later on to complete the dissolving process. It's often useful to leave this
overnight.
8. Once fully dissolved, spin at 25000g for 20 minutes and remove the supernatant.
Often, the pellet at this point is like jelly and is the same colour as the supernatant so it
can barely be seen. Carefully pour off the supernatant into a fresh tube and leave the
pellet behind.

Sau khi em rửa pellet với dung dịch có chứa Triton thì em thu được 1 cục cặn lớn, nhưng nó không phải màu vàng mà nó màu trắng. Em cho 3ml dung dịch chứa 8M urea, 50mM Tris, 100mM NaCl vào để làm tan tủa. Nhưng nó không tan, cục cặn của em hình như có tan được một ít, phần còn lại thì biến thành màu đen. Em ly tâm và thu dịch nổi thì thấy dịch nổi không có dầu hiệu gì là có protein.
Em muốn hỏi anh là cục cặn màu đen đó có phải là những mảnh vỡ của tế bào không?Và em có làm sai bước nào không mà tại sao không thu được protein.
Em cám ơn.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Sau khi em rửa pellet với dung dịch có chứa Triton thì em thu được 1 cục cặn lớn, nhưng nó không phải màu vàng mà nó màu trắng. Em cho 3ml dung dịch chứa 8M urea, 50mM Tris, 100mM NaCl vào để làm tan tủa. Nhưng nó không tan, cục cặn của em hình như có tan được một ít, phần còn lại thì biến thành màu đen. Em ly tâm và thu dịch nổi thì thấy dịch nổi không có dầu hiệu gì là có protein.
Em muốn hỏi anh là cục cặn màu đen đó có phải là những mảnh vỡ của tế bào không?Và em có làm sai bước nào không mà tại sao không thu được protein.

Inclussion body của protein nhiều khả năng vẫn là cục màu đen đó, nhưng anh chưa từng bao giờ gặp trường hợp nó chuyển sang màu đen. Có một loại hóa chất nào của em bị lẫn tạp chăng? Lặp lại xem có phải tất cả các sample đầu bị thành màu đen như vậy không?

 

[Lê Hồng Đức]

8. Once fully dissolved, spin at 25000g for 20 minutes and remove the supernatant.
Often, the pellet at this point is like jelly and is the same colour as the supernatant so it
can barely be seen. Carefully pour off the supernatant into a fresh tube and leave the
pellet behind.

Sau khi em rửa pellet với dung dịch có chứa Triton thì em thu được 1 cục cặn lớn, nhưng nó không phải màu vàng mà nó màu trắng. Em cho 3ml dung dịch chứa 8M urea, 50mM Tris, 100mM NaCl vào để làm tan tủa. Nhưng nó không tan, cục cặn của em hình như có tan được một ít, phần còn lại thì biến thành màu đen. Em ly tâm và thu dịch nổi thì thấy dịch nổi không có dầu hiệu gì là có protein.
Em muốn hỏi anh là cục cặn màu đen đó có phải là những mảnh vỡ của tế bào không?Và em có làm sai bước nào không mà tại sao không thu được protein.
Em cám ơn.

Chào Khôn, bước số 7 làm tan inclusion body của em rồi, bước số 8 nhằm loại bỏ những phần không tan được, chứ không phải tủa lại protein của em đâu, em đọc kỹ lại xem. Sau bước số 8, họ có bảo đổ supernatant đi đâu, họ bảo đổ vào 1 tuýp sạch khác cơ mà, còn cục cặn thì mới vứt đi.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Chào Khôn, bước số 7 làm tan inclusion body của em rồi, bước số 8 nhằm loại bỏ những phần không tan được, chứ không phải tủa lại protein của em đâu, em đọc kỹ lại xem. Sau bước số 8, họ có bảo đổ supernatant đi đâu, họ bảo đổ vào 1 tuýp sạch khác cơ mà, còn cục cặn thì mới vứt đi.

Hì hì, đúng rồi. Nhưng em vẫn thường giữ lại cặn rồi bỏ sample loading buffer xem mình còn để lỡ bao nhiêu protein ở inclusion body mà ko hòa tan ra được.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Thực ra tôi ko hiểu sao protocol của Khôn lại phức tạp thế. Mấy lần định làm thử để so sánh nhưng lại ngại. Tôi thì làm cách nhanh gọn hơn và cũng hiệu quả là thực hiện giống như việc bạn tách protein bình thường để tinh sạch His-tag.

http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=1910

Tuy nhiên, chỉ việc bổ sung 8M ure vào đệm tách (lysis buffer), rồi sau mỗi lần tinh sạch các dung dịch wash buffer, elution buffer đều phải cho 8M ure tương tự. Lấy mẫu đó so sánh với mẫu tách ko cho ure thì sẽ biết hiệu quả. Việc tinh sạch trong điều kiện biến tính cũng cho kết quả sạch hơn.

Khôn thử protocol của tôi rồi so sánh với của bạn xem. Nếu của bạn tốt hơn thì tôi sẽ thử lại .

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chào mọi người,
Em có một thắc mắc nho nhỏ là resin sau khi được dùng để tinh sạch protein ở điều kiện biến tính (8M urea) thì có bị ảnh hưởng gì không? Sau khi tinh sạch ở điều kiện biến tính xong, em có thể sử dụng lại resin này để tinh sạch protein ở điều kiện tự nhiên ko và nó có ảnh hưởng gì đến protein của em không?
Em xin cảm ơn mọi người đã nhiệt tình trao đổi kinh nghiệm.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em có một thắc mắc nho nhỏ là resin sau khi được dùng để tinh sạch protein ở điều kiện biến tính (8M urea) thì có bị ảnh hưởng gì không? Sau khi tinh sạch ở điều kiện biến tính xong, em có thể sử dụng lại resin này để tinh sạch protein ở điều kiện tự nhiên ko và nó có ảnh hưởng gì đến protein của em không?

Hầu như không ảnh hưởng. Tuy nhiên chỉ nên sử dụng lại để tinh sạch protein đã dùng với resin này trước đó. Sau vài lần tái sử dụng thì nên tái tạo lại resin. Bạn có thể search với keyword "resin regeneration" or "regenration beads" hoặc đại loại thế để lấy protocol.

 

[Bùi Hoàng Phúc]

mình có thắc mắc là người ta thưởng đo nồng độ protein có hoạt tính bằng ELISA, còn kĩ thuật nào khác để xác định chính xác hơn không? vì theo mình ELISA chỉ đặc hiệu cho một phần của protein cần . nếu một protein khác cũng có cấu trúc giống nhau ở phần đó thì khi đo sẽ không chính xác nữa. có thể dùng phương pháp NMR (cộng hưởng từ hạt nhân) để xác định đúng protein mình cần không?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em mới đọc được một bài giảng của GS trong môn học Industrial biotechnology. Trong đó có đề cập đến: nếu như protein của mình biểu hiện ở dạng inclusion body, thì một trong những cách khắc phục (ngoài việc giảm nhiệt độ nuôi cấy, thay đổi pH...) là sử dụng môi trường giàu dinh dưỡng ( Vì dụ như 2x LB media). Không biết có anh chị nào biết rõ về thông tin này không? Ý em là biết rõ là trường hợp nào thì nên dùng 2x LB?

 

[Lê Tiến Dũng]

Em mới đọc được một bài giảng của GS trong môn học Industrial biotechnology. Trong đó có đề cập đến: nếu như protein của mình biểu hiện ở dạng inclusion body, thì một trong những cách khắc phục (ngoài việc giảm nhiệt độ nuôi cấy, thay đổi pH...) là sử dụng môi trường giàu dinh dưỡng ( Vì dụ như 2x LB media). Không biết có anh chị nào biết rõ về thông tin này không? Ý em là biết rõ là trường hợp nào thì nên dùng 2x LB?

Trước khi xác định cách xử lý phù hợp thì bạn nên kiểm tra xem cái protein của bạn có transmembrane domain hay không. Nếu không thuộc loại này thì có thể dùng thêm cách sau:
1- bạn nuôi cấy và induced bình thường, (best at 20oC)
2- Trước khi harvesst cell, bạn cho chloramphenicol vào dung dịch nuôi cấy (200ug/mL) và tiếp tục lắc thêm 2h nữa ở 20oC
3- Harvest the cell, cách này đã đăng trên 1 bài báo trên FEBS letter.

 

[anyong]

Mình đang biểu hiện gen mã hóa cho protein thuộc họ P450s và muốn thu protein ở dạng soluble vì phải làm về cấu trúc. Mình muốn hỏi là điện di protein biến tính (SDS-PAGE) có thể phân biệt được soluble protein và inclusion body không?, và không biết có cách nào để nhận biết được hai dạng protein này

 

[Lê Tiến Dũng]

Mình đang biểu hiện gen mã hóa cho protein thuộc họ P450s và muốn thu protein ở dạng soluble vì phải làm về cấu trúc. Mình muốn hỏi là điện di protein biến tính (SDS-PAGE) có thể phân biệt được soluble protein và inclusion body không?, và không biết có cách nào để nhận biết được hai dạng protein này

Câu trả lời là không!