Trịnh Thị Hồng Nhung
Member
trong kỹ thuật tách ADN nhiều chỗ nói:ADN sau khi bị tách protein, cho vào dung dịch cồn sẽ bị "kết tủa" :?: Mọi người có biết tại sao không? Theo em thì hình như không phải như vậy.
ADN có bị kết tủa bởi cồn hay không?
- Thread starter Trịnh Thị Hồng Nhung
- Start date
Vũ Anh Thắng
Member
bạn ơi người ta dùng cồn để làm sạch ADN thui chứ không phải để kết tủa đâu. Theo mình là như vậy không hiểu ý kiến của mọi người ra sao
Trịnh Thị Hồng Nhung
Member
rất mong mọi ngừơi sớm góp ý 
Hoàng Anh Hoàng
Member
Theo mình nghĩ phương pháp tủa DNA các bạn đang quan tâm ở đây là tủa DNA bằng phương pháp sử dụng kết hợp các cation đơn hóa trị và ethanol: Khi có mặt cation đơn hóa trị( ion Na+, NH4+ trong muối) và cồn khoảng 95% thì các axit Nu trong dung dịch sẽ tủa xuống ở nhiệt độ thấp từ 0 đến -70 độ C. Thời gian ủ càng lâu thì hiệu suất thu hồi DNA càng lớn( thường ủ qua đêm ở nhiệt độ -20 độ C).
Các bạn có phương án nào không nếu ta tách chiết DNA của plasmid ra khỏi DNA của genome?
Các bạn có phương án nào không nếu ta tách chiết DNA của plasmid ra khỏi DNA của genome?
Luyện Quốc Hải
Member
Xin chào các bạn.
? Nội dung câu hỏi của một vấn đề rất cơ bản trong thực nghiệm. Qua đây Tôi xin tổng hợp một số thông tin để giúp mọi người tham khảo và cùng nhau hoàn thiện. Mong mọi người ?kiểm tra bằng thực nghiệm một số thông tin đề cập dưới đây.
I. Tại sao DNA lại có thể bị kết tủa bởi Alcohol?
? DNA là dễ hoà tan trong các dung môi ưa nước vì nó tương tác với các phân tử của dung môi. Nhưng vì các alcohol (ví dụ: methanol, ethanol, isopropanol…) là có ái lực với nước mạnh hơn DNA/RNA, do đó nó phá vỡ mối tương tác giữa nước và nucleic, sau đó chúng kết hợp với các phân tử nước. Kết quả là DNA/RNA bị kết tủa (điều này cũng có sự giải thích tương tự với trường hợp kết tủa bằng muối).
Khả năng kết tủa nucleic phụ thuộc vào tuỳ loại alcohol (Ví dụ: ?methanol <ethanol < isopropanol) nhưng khả năng bay hơi lại giảm methanol > ethanol > isopropanol…..Tóm lại: DNA sẽ tủa tốt hơn khi sử dụng các alcohol hoà tan tốt hơn trong nước.
? Ở nhiệt độ thấp, sự kết tủa DNA cũng diễn ra dễ dàng hơn. Có thể suy luận: ở nhiệt độ thấp thì ái lực của Alcohol và nước tăng làm cho nucleic kết tủa tốt hơn.
II. Khi nào thì chọn Ethanol vs isopropanol:
? ? ? ?Trước hết nên xem bảng so sánh sau:
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Ethanol ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Isopropanol
Thời gian ở -20[sup:206788e29f]0[/sup:206788e29f]C tủa qua đêm (có nghĩa là tủa chậm hơn) ở -20[sup:206788e29f]0[/sup:206788e29f]C tủa trong 1.5- ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2h (có nghĩa là tủa nhanh hơn)
Thể tích: 2.5 V – 3V (nói chung là cho nồng độ cuối cùng là ? ? ? 1 V (nói chung là cho nồng độ cuối cùng là
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? khoảng 60-80%) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?khoảng 40-50%)
Hiệu xuất: Có người nói là hiệu xuất tủa của Ethanol cao hơn Isopropanol 60% (thông tin này cần được kiểm
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?tra)
Giá thành: ? ?Tất nhiên là dùng Isopropanol sẽ tiết kiệm hơn vì dùng ít thể tích hơn.
Khuyết điểm: ? ? ? ? Lượng muối kết tủa bởi Isopropanol nhiều hơn Ethanol
Làm khô: Ethanol khô nhanh hơn
? ?
- Việc chọn alcohol nào là phụ thuộc vào thời gian và thể tích của mẫu. Có nghĩa là: nếu bạn có ít thời gian và tổng thể tích mẫu cần tủa lại lớn (mà thể tích ống Effendorf có hạn) thì nên dùng Isopropanol.
? ?- Việc dùng isopropanol cũng cho hiệu quả cao hơn trong việc loại bỏ các primer và các đoạn cắt nhỏ khi dùng phản ứng cắt enzyme giới hạn. Đặc biệt là khi muốn tủa các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 6kb thì nên dùng isopropanol. Trong khi đó, nếu muốn thu nhận các đoạn có kích thước nhỏ (có thể chỉ 10bp) thì nên dùng Ethanol.
? - Giải thích nguyên nhân vì sao Isopropanol lại tủa nhiều muối hơn ethanol: Do Isopropanol kém bay hơi hơn ethanol (hay là kém linh động hơn), do đó nhiều muối kém hoà tan hơn trong Isopropanol và sẽ bị kết tủa theo DNA.
Một số điểm chú ý thêm:
- Tại sao lại dùng ethanol 70% mà không phải là 100%: vì ethanol 70% có chứa 30% là nước. Với 30% là nước này giúp cho việc hoà tan các muối, các protein hoà tan trong nước, các carbonhydrate ….và từ đó giúp loại bỏ chúng.
- Đã tủa bằng Isopropanol thì chắc chắn phải rửa tủa bằng ethanol 70%.
- Có thể rút ngắn thời gian tủa bằng cách dội qua N2 lỏng.
- Có thể tủa bằng Isopropanol ở ngay nhiệt độ phòng.
- Nên dùng alcohol đã được làm lạnh ở -200C để tủa.
- Một số người cũng đã dùng thử 9V Butanol và cho kết quả rất tốt.
- Làm sao để tăng hiệu xuất tủa: Nồng độ alcohol cao hơn, thời gian tủa lâu hơn, nhiệt độ tủa thấp hơn, và thời gian ly tâm thu tủa lâu hơn là những yếu tổ cải thiện hiệu xuất tủa của DNA.
- Chú ý: thời gian và nhiệt độ là yếu tố quyết định khi mà nồng độ nucleic là thấp, nhưng nếu nồng độ >0,25 mg/ml thì việc tủa có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng và nên rửa tủa bằng ethanol 70% để loại muối.
- Cục tủa sẽ hoà tan tốt hơn trong nước và TE và ở nồng độ <1mg/ml. Việc gia tăng nhiệt nhẹ nhàng cũng có thể giúp cho việc hoà tan nucleic được dễ dàng hơn.
- Alcohol rất dễ hấp thu nước có trong không khí, do đó % alcohol cũng chỉ mang tính tương đối.
III. Một số phương pháp bổ sung
Ngoài việc sử dụng các alcohol để tủa thì có thể kết hợp với các phương pháp sau để đạt được kết quả mong muốn:
1. Muối là cần cho sự tủa và các cation của nó trung hoà lực đẩy gây ra bởi các đầu phân cực âm của khung phosphate (của mạch DNA).
- Việc dùng alcohol để kết tủa nucleic thường được kết hợp với một nồng độ cao các muối vô cơ như: 0.8M LiCl, 0.3-0.5M NaCl, NaOAc, hay 2.5M NH4Ac.
- Ammonium acetate thường được dùng vì nó dễ bay hơi và dễ dàng loại bỏ hơn so với việc dùng Sodium acetate (NaOAc) (NaOAc có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình cloning sau này). Ở nồng độ cao, nó tủa chọn lọc các phân tử có MW lớn.
- LiCl thường được dùng cho RNA bởi vì Li[sup:206788e29f]+[/sup:206788e29f] không kết tủa DNA sợi đôi, protein tan trong nước, và các carbohydrate, mặc dù RNA phải có trên 300 Nu.
2. Polyethylene glycol (PEG) để tủa DNA có MW lớn, nhưng nó lại khó làm khô và cũng gây khó khăn trong các thí nghiệm tiếp theo (ligation….).
3. Trichloroacetic acid (TCA) cũng có thể dùng cho việc tủa DNA có MW <5kDa, nhưng acid nucleic không thể thu lại đúng hình dạng ban đầu.
4. Ngoài ra, có thể dùng Glycogen như một chất mang DNA khi mà nồng độ DNA rất thấp.
? ? ? ?Tại sao có thể dùng Glycogen trong việc thu nhận DNA: Vì Glycogen được xem là một chất mang trơ (glycogen là một loại protein có trong cơ) và nó là một proteoglycan mạch dài nên dễ dàng tủa kéo theo DNA ở xung quanh khi ta ly tâm. Phương pháp này cũng cho hiệu quả cao, giúp có thể dễ dàng nhìn thấy “tủa” hơn, chất lượng DNA đủ để làm các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, nếu DNA có MW trung bình - > lớn thì cũng không cần đến phương pháp này.
? ? ? ? ? Dùng bao nhiêu Glycogen trong một lần tủa: Nồng độ 1- 100ug/ml (nên kiểm tra nồng độ tối ưu).
? ? ? ? ? ? Bổ sung Glycogen khi nào? Bổ sung và trộn đều trước khi cho alcohol.
Tài liệu tham khảo: Sách Molecular ?Biology Problem solver: A Laboratory Guide: Edited by Alan S. Gerstein (2001).
và một số nguồn thông tin khác.
P/S: Mong BQT sửa giúp bảng so sánh cho đúng vị trí
? Nội dung câu hỏi của một vấn đề rất cơ bản trong thực nghiệm. Qua đây Tôi xin tổng hợp một số thông tin để giúp mọi người tham khảo và cùng nhau hoàn thiện. Mong mọi người ?kiểm tra bằng thực nghiệm một số thông tin đề cập dưới đây.
I. Tại sao DNA lại có thể bị kết tủa bởi Alcohol?
? DNA là dễ hoà tan trong các dung môi ưa nước vì nó tương tác với các phân tử của dung môi. Nhưng vì các alcohol (ví dụ: methanol, ethanol, isopropanol…) là có ái lực với nước mạnh hơn DNA/RNA, do đó nó phá vỡ mối tương tác giữa nước và nucleic, sau đó chúng kết hợp với các phân tử nước. Kết quả là DNA/RNA bị kết tủa (điều này cũng có sự giải thích tương tự với trường hợp kết tủa bằng muối).
Khả năng kết tủa nucleic phụ thuộc vào tuỳ loại alcohol (Ví dụ: ?methanol <ethanol < isopropanol) nhưng khả năng bay hơi lại giảm methanol > ethanol > isopropanol…..Tóm lại: DNA sẽ tủa tốt hơn khi sử dụng các alcohol hoà tan tốt hơn trong nước.
? Ở nhiệt độ thấp, sự kết tủa DNA cũng diễn ra dễ dàng hơn. Có thể suy luận: ở nhiệt độ thấp thì ái lực của Alcohol và nước tăng làm cho nucleic kết tủa tốt hơn.
II. Khi nào thì chọn Ethanol vs isopropanol:
? ? ? ?Trước hết nên xem bảng so sánh sau:
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Ethanol ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Isopropanol
Thời gian ở -20[sup:206788e29f]0[/sup:206788e29f]C tủa qua đêm (có nghĩa là tủa chậm hơn) ở -20[sup:206788e29f]0[/sup:206788e29f]C tủa trong 1.5- ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2h (có nghĩa là tủa nhanh hơn)
Thể tích: 2.5 V – 3V (nói chung là cho nồng độ cuối cùng là ? ? ? 1 V (nói chung là cho nồng độ cuối cùng là
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? khoảng 60-80%) ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?khoảng 40-50%)
Hiệu xuất: Có người nói là hiệu xuất tủa của Ethanol cao hơn Isopropanol 60% (thông tin này cần được kiểm
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?tra)
Giá thành: ? ?Tất nhiên là dùng Isopropanol sẽ tiết kiệm hơn vì dùng ít thể tích hơn.
Khuyết điểm: ? ? ? ? Lượng muối kết tủa bởi Isopropanol nhiều hơn Ethanol
Làm khô: Ethanol khô nhanh hơn
? ?
- Việc chọn alcohol nào là phụ thuộc vào thời gian và thể tích của mẫu. Có nghĩa là: nếu bạn có ít thời gian và tổng thể tích mẫu cần tủa lại lớn (mà thể tích ống Effendorf có hạn) thì nên dùng Isopropanol.
? ?- Việc dùng isopropanol cũng cho hiệu quả cao hơn trong việc loại bỏ các primer và các đoạn cắt nhỏ khi dùng phản ứng cắt enzyme giới hạn. Đặc biệt là khi muốn tủa các đoạn DNA có kích thước lớn hơn 6kb thì nên dùng isopropanol. Trong khi đó, nếu muốn thu nhận các đoạn có kích thước nhỏ (có thể chỉ 10bp) thì nên dùng Ethanol.
? - Giải thích nguyên nhân vì sao Isopropanol lại tủa nhiều muối hơn ethanol: Do Isopropanol kém bay hơi hơn ethanol (hay là kém linh động hơn), do đó nhiều muối kém hoà tan hơn trong Isopropanol và sẽ bị kết tủa theo DNA.
Một số điểm chú ý thêm:
- Tại sao lại dùng ethanol 70% mà không phải là 100%: vì ethanol 70% có chứa 30% là nước. Với 30% là nước này giúp cho việc hoà tan các muối, các protein hoà tan trong nước, các carbonhydrate ….và từ đó giúp loại bỏ chúng.
- Đã tủa bằng Isopropanol thì chắc chắn phải rửa tủa bằng ethanol 70%.
- Có thể rút ngắn thời gian tủa bằng cách dội qua N2 lỏng.
- Có thể tủa bằng Isopropanol ở ngay nhiệt độ phòng.
- Nên dùng alcohol đã được làm lạnh ở -200C để tủa.
- Một số người cũng đã dùng thử 9V Butanol và cho kết quả rất tốt.
- Làm sao để tăng hiệu xuất tủa: Nồng độ alcohol cao hơn, thời gian tủa lâu hơn, nhiệt độ tủa thấp hơn, và thời gian ly tâm thu tủa lâu hơn là những yếu tổ cải thiện hiệu xuất tủa của DNA.
- Chú ý: thời gian và nhiệt độ là yếu tố quyết định khi mà nồng độ nucleic là thấp, nhưng nếu nồng độ >0,25 mg/ml thì việc tủa có thể tiến hành ở nhiệt độ phòng và nên rửa tủa bằng ethanol 70% để loại muối.
- Cục tủa sẽ hoà tan tốt hơn trong nước và TE và ở nồng độ <1mg/ml. Việc gia tăng nhiệt nhẹ nhàng cũng có thể giúp cho việc hoà tan nucleic được dễ dàng hơn.
- Alcohol rất dễ hấp thu nước có trong không khí, do đó % alcohol cũng chỉ mang tính tương đối.
III. Một số phương pháp bổ sung
Ngoài việc sử dụng các alcohol để tủa thì có thể kết hợp với các phương pháp sau để đạt được kết quả mong muốn:
1. Muối là cần cho sự tủa và các cation của nó trung hoà lực đẩy gây ra bởi các đầu phân cực âm của khung phosphate (của mạch DNA).
- Việc dùng alcohol để kết tủa nucleic thường được kết hợp với một nồng độ cao các muối vô cơ như: 0.8M LiCl, 0.3-0.5M NaCl, NaOAc, hay 2.5M NH4Ac.
- Ammonium acetate thường được dùng vì nó dễ bay hơi và dễ dàng loại bỏ hơn so với việc dùng Sodium acetate (NaOAc) (NaOAc có thể ảnh hưởng không tốt đến quá trình cloning sau này). Ở nồng độ cao, nó tủa chọn lọc các phân tử có MW lớn.
- LiCl thường được dùng cho RNA bởi vì Li[sup:206788e29f]+[/sup:206788e29f] không kết tủa DNA sợi đôi, protein tan trong nước, và các carbohydrate, mặc dù RNA phải có trên 300 Nu.
2. Polyethylene glycol (PEG) để tủa DNA có MW lớn, nhưng nó lại khó làm khô và cũng gây khó khăn trong các thí nghiệm tiếp theo (ligation….).
3. Trichloroacetic acid (TCA) cũng có thể dùng cho việc tủa DNA có MW <5kDa, nhưng acid nucleic không thể thu lại đúng hình dạng ban đầu.
4. Ngoài ra, có thể dùng Glycogen như một chất mang DNA khi mà nồng độ DNA rất thấp.
? ? ? ?Tại sao có thể dùng Glycogen trong việc thu nhận DNA: Vì Glycogen được xem là một chất mang trơ (glycogen là một loại protein có trong cơ) và nó là một proteoglycan mạch dài nên dễ dàng tủa kéo theo DNA ở xung quanh khi ta ly tâm. Phương pháp này cũng cho hiệu quả cao, giúp có thể dễ dàng nhìn thấy “tủa” hơn, chất lượng DNA đủ để làm các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, nếu DNA có MW trung bình - > lớn thì cũng không cần đến phương pháp này.
? ? ? ? ? Dùng bao nhiêu Glycogen trong một lần tủa: Nồng độ 1- 100ug/ml (nên kiểm tra nồng độ tối ưu).
? ? ? ? ? ? Bổ sung Glycogen khi nào? Bổ sung và trộn đều trước khi cho alcohol.
Tài liệu tham khảo: Sách Molecular ?Biology Problem solver: A Laboratory Guide: Edited by Alan S. Gerstein (2001).
và một số nguồn thông tin khác.
P/S: Mong BQT sửa giúp bảng so sánh cho đúng vị trí
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
Cám ơn anh Hải đã viết một bài khá đầy đủ về một kiến thức cơ bản trong thực nghiệm.
Trước đến giờ tôi cứ hình dung thế này về hòa tan:
+ Hòa tan trong nước: các phân tử nước làm thành các mạng "nhện" và các phân tử hòa tan bám vào trên đó. Chừng nào lực của phân tử nước còn giữ được các phân tử hòa tan thì nó còn "tan", nếu không nó bị rớt xuống đáy bình vì trọng lực. Thêm muối háo nước, ví dụ (NH4)2SO4, sẽ làm giảm số phân tử nước giữ các phân tử tan, làm cho các phân tử tan này lắng xuống "kết tủa" (ví dụ salting out).
+ Cồn, acetone...v.v có độ phân cực yếu hơn nước nên không đủ lực giữ các phân tử hòa tan này, khiến chúng bị rớt xuống đáy bình theo trọng lực. Lẽ đương nhiên 100% cũng xài được, nhưng như anh Hải đã nói: nếu 100% thì tất cả sẽ bị tủa, còn ở 70% phần lớn DNA tủa còn một số chất không mong muốn vẫn còn lơ lửng được (ví dụ chúng có độ ion mạnh hơn DNA).
+ Sử dụng nhiệt độ thấp để đẩy nhanh sự kết tủa và tránh dung môi bay hơi.
Trước đến giờ tôi cứ hình dung thế này về hòa tan:
+ Hòa tan trong nước: các phân tử nước làm thành các mạng "nhện" và các phân tử hòa tan bám vào trên đó. Chừng nào lực của phân tử nước còn giữ được các phân tử hòa tan thì nó còn "tan", nếu không nó bị rớt xuống đáy bình vì trọng lực. Thêm muối háo nước, ví dụ (NH4)2SO4, sẽ làm giảm số phân tử nước giữ các phân tử tan, làm cho các phân tử tan này lắng xuống "kết tủa" (ví dụ salting out).
+ Cồn, acetone...v.v có độ phân cực yếu hơn nước nên không đủ lực giữ các phân tử hòa tan này, khiến chúng bị rớt xuống đáy bình theo trọng lực. Lẽ đương nhiên 100% cũng xài được, nhưng như anh Hải đã nói: nếu 100% thì tất cả sẽ bị tủa, còn ở 70% phần lớn DNA tủa còn một số chất không mong muốn vẫn còn lơ lửng được (ví dụ chúng có độ ion mạnh hơn DNA).
+ Sử dụng nhiệt độ thấp để đẩy nhanh sự kết tủa và tránh dung môi bay hơi.
Trần Ánh Hồng
Member
Cảm ơn anh Hải và anh Lương đã cho tụi em biết thêm những kiến thức quý giá .
Một số tài liệu em đọc được còn đề cập :
- Ion được dùng thường phụ thuộc vào thể tích DNA và các xử lý tiếp theo . VD: Natri acetate ức chế phân đoạn Klenow , ion amoni ức chế T4 polynucleotide kinase và ion chlorua ức chế DNA polymerase phụ thuộc RNase .
- Bổ sung MgCl2 vào với nồng độ cuối cùng : 10mM giúp tủa các phân đoạn DNA nhỏ và các oligonucleotide .
- Amoni acetate thường được dùng vì nó rất dễ hòa tan trong ethanol và được loại bỏ dễ dàng khi rửa với 70% Ethanol.
- Còn dùng isobutanol để cô đặc DNA , nhưng em không biết trong trường hợp nào mới sử dụng tới nó (có lẽ không phổ biến !)
- Có tài liệu còn nói rằng : dùng Ethanol 95% để tủa ở -200C , rồi Ethanol 70% để rửa tủa , em không biết tại sao nhưng có lẽ như anh Hải nói , % Ethanol cũng chỉ mang tính tương đối thôi phải không ?
- Ngoài ra , Isopropanol thường được dùng để tinh sạch plasmid số lượng lớn .
@Hoàng Anh Hoàng : Em chưa hiểu lắm câu hỏi . Anh Hoàng muốn tách DNA cần ra khỏi plasmid hay tách nguyên cả plasmid chứa đoạn DNA cần ra khỏi vi khuẩn ?
Một số tài liệu em đọc được còn đề cập :
- Ion được dùng thường phụ thuộc vào thể tích DNA và các xử lý tiếp theo . VD: Natri acetate ức chế phân đoạn Klenow , ion amoni ức chế T4 polynucleotide kinase và ion chlorua ức chế DNA polymerase phụ thuộc RNase .
- Bổ sung MgCl2 vào với nồng độ cuối cùng : 10mM giúp tủa các phân đoạn DNA nhỏ và các oligonucleotide .
- Amoni acetate thường được dùng vì nó rất dễ hòa tan trong ethanol và được loại bỏ dễ dàng khi rửa với 70% Ethanol.
- Còn dùng isobutanol để cô đặc DNA , nhưng em không biết trong trường hợp nào mới sử dụng tới nó (có lẽ không phổ biến !)
- Có tài liệu còn nói rằng : dùng Ethanol 95% để tủa ở -200C , rồi Ethanol 70% để rửa tủa , em không biết tại sao nhưng có lẽ như anh Hải nói , % Ethanol cũng chỉ mang tính tương đối thôi phải không ?
- Ngoài ra , Isopropanol thường được dùng để tinh sạch plasmid số lượng lớn .
@Hoàng Anh Hoàng : Em chưa hiểu lắm câu hỏi . Anh Hoàng muốn tách DNA cần ra khỏi plasmid hay tách nguyên cả plasmid chứa đoạn DNA cần ra khỏi vi khuẩn ?
Luyện Quốc Hải
Member
Xin chào
Cảm ơn ý kiến bổ sung của mọi người. Qua đây Tôi cũng muốn trao đổi thêm để làm sáng tỏ một số vấn đề sau:
Theo anh Lương:
Theo ý Tôi: Thông thường, trước khi bổ sung alcohol thì DNA đang hòa tan trong nước và như vậy thì CHÍNH NƯỚC đang là yếu tố "nắm giữ" DNA (chứ không phải là alcohol hay các yếu tố khác). Sau khi bổ sung alcohol vào thì xảy ra sự cạnh tranh - Chất nào có ái lực mạnh hơn với nước (so với chất kia) thì liên kết được với nước. Nói một cách đơn giản hơn: chính alcohol đã đẩy DNA vào "đường cùng" = phải kết tủa (chứ không phải là nước).
Đây cũng là một vấn đề cần làm sáng tỏ:
Khi ta đọc một số sách hay theo cách suy nghĩ của một số người thì: Cồn 100% dùng để tủa, sau đó dùng cồn 70% để rửa tủa.
Trong thực nghiêm, "nếu 100% thì tất cả sẽ bị tủa" vừa ĐÚNG vừa KHÔNG ĐÚNG.
- Đúng: nếu muốn tủa ở nồng độ cồn 100% thì có nghĩa là dịch DNA cần tủa đã được làm KHÔ và sau đó bổ sung cồn 100% vào (thì lúc đó nồng độ cồn trong dung dịch tủa mới đạt được 100%) => như vậy, việc làm này không có ý nghĩa gì (vì tất cả mọi thứ đã được "Tủa = làm khô" trước khi cho cồn 100% vào rồi).
- Không đúng: Là vì chẳng ai tủa DNA ở nồng độ cồn 100% cả.
Vấn đề là chúng ta hay hiểu nhầm ở đây, thông thường ta sẽ bổ sung 2.5 - 3V ethanol 100% vào trong dung dịch cần tủa DNA. Như vậy: 1V (của dung dịch cần tủa DNA) + 2.5-3V ethanol 100% => cho ra nồng độ ethanol ~ 70%. (nói cách khác: dùng cồn 100% để tủa nhằm mục đích tạo ra được nồng độ cuối cùng của cồn trong dung dịch tủa là ~70%).
Còn khi ta rửa tủa thì dùng cồn 70% vì lúc này chỉ còn DNA đã bị tủa ở dưới thành ống
Tóm lại: cần phải hiểu nồng độ Ethanol dùng để tủa và rửa tủa đều như nhau và bằng ~70%.
Chân thành cảm ơn.
Cảm ơn ý kiến bổ sung của mọi người. Qua đây Tôi cũng muốn trao đổi thêm để làm sáng tỏ một số vấn đề sau:
Theo anh Lương:
Nếu hiểu nghĩa câu nói của anh Lương thì: Nước được bổ sung vào để phá vỡ mối liên kết giữa DNA - alcohol => DNA bị kết tủa.
Theo ý Tôi: Thông thường, trước khi bổ sung alcohol thì DNA đang hòa tan trong nước và như vậy thì CHÍNH NƯỚC đang là yếu tố "nắm giữ" DNA (chứ không phải là alcohol hay các yếu tố khác). Sau khi bổ sung alcohol vào thì xảy ra sự cạnh tranh - Chất nào có ái lực mạnh hơn với nước (so với chất kia) thì liên kết được với nước. Nói một cách đơn giản hơn: chính alcohol đã đẩy DNA vào "đường cùng" = phải kết tủa (chứ không phải là nước).
Đây cũng là một vấn đề cần làm sáng tỏ:
Khi ta đọc một số sách hay theo cách suy nghĩ của một số người thì: Cồn 100% dùng để tủa, sau đó dùng cồn 70% để rửa tủa.
Trong thực nghiêm, "nếu 100% thì tất cả sẽ bị tủa" vừa ĐÚNG vừa KHÔNG ĐÚNG.
- Đúng: nếu muốn tủa ở nồng độ cồn 100% thì có nghĩa là dịch DNA cần tủa đã được làm KHÔ và sau đó bổ sung cồn 100% vào (thì lúc đó nồng độ cồn trong dung dịch tủa mới đạt được 100%) => như vậy, việc làm này không có ý nghĩa gì (vì tất cả mọi thứ đã được "Tủa = làm khô" trước khi cho cồn 100% vào rồi).
- Không đúng: Là vì chẳng ai tủa DNA ở nồng độ cồn 100% cả.
Vấn đề là chúng ta hay hiểu nhầm ở đây, thông thường ta sẽ bổ sung 2.5 - 3V ethanol 100% vào trong dung dịch cần tủa DNA. Như vậy: 1V (của dung dịch cần tủa DNA) + 2.5-3V ethanol 100% => cho ra nồng độ ethanol ~ 70%. (nói cách khác: dùng cồn 100% để tủa nhằm mục đích tạo ra được nồng độ cuối cùng của cồn trong dung dịch tủa là ~70%).
Còn khi ta rửa tủa thì dùng cồn 70% vì lúc này chỉ còn DNA đã bị tủa ở dưới thành ống
Tóm lại: cần phải hiểu nồng độ Ethanol dùng để tủa và rửa tủa đều như nhau và bằng ~70%.
Thực chất, chúng ta sẽ không bao giờ có cồn 100%, mà thông thường chỉ vào khoảng 95% (vì mỗi lần mở nắp ra thì alcohol sẽ hấp thụ nước từ trong không khí vào). Do đó, việc dùng cồn 100%, hay 95% đều có nghĩa như nhau. Nhưng chúng ta phải hiểu vấn đề chính đã được nêu ở trên.
Chân thành cảm ơn.
Trần Ánh Hồng
Member
Bây giờ em hiểu rồi . Xin cám ơn chỉ dẫn của anh Hải rất nhiều ^_^
Nguyễn Ngọc Lương
Administrator
Cám ơn anh Hải ngồi đọc cẩn thận bài của tôi. Nhưng tôi nghĩ anh đang hiểu nhầm ý tôi.
Thứ nhất tôi chỉ dùng ví dụ để ví von khái niệm hòa tan và kết tủa theo kiểu "giảm độ ion dung môi" vì yếu tố kết tủa này khác với kiểu kết tủa trong Hóa học kiểu chất A hay chất B không tan thì nó kết tủa. Ở đây protein hoặc DNA vốn tan trong nước với một lượng nào đó, nếu tăng độ muối chúng sẽ tan nhiều hơn nữa, nếu cho các chất cạnh tranh nước với chúng thì chúng yếu hơn sẽ bị lấy bớt nước và bị kết tủa do nước không còn đủ lực giữ nó (tức thêm cồn vào nước chứ không phải thêm nước vào cồn, mặc dù về bản chất nó không khác nhau chỗ nào cả).
Đối với trường hợp cồn 70% và 100% thì tôi nghĩ anh hiểu sai ý tôi ở chỗ, lúc này nước chiếm phần ít nên bản thân nó cũng là chất tan, còn cồn mới chính là dung môi (xem định nghĩa dung môi trong sách Hóa). Một chất tan trong dung môi cồn có nghĩa là các phân tử cồn đủ lực giữ nó lơ lửng, nếu không thì chất đó sẽ bị kết tủa "trong dung môi cồn". Còn cái ví dụ cồn 100% tôi chưa bao giờ thử và cũng không rõ kết quả thế nào, nhưng theo lập luận của anh Hải thì có lẽ nó kết tủa yếu hơn cồn 70% bởi không có nước để cạnh tranh với các chất tan trong dung môi cồn, đúng không nhỉ? Còn nếu xem nước là dung môi trong trường hợp này thì nồng độ cồn càng cao kết tủa càng nhiều (mà có lẽ sai). Có lẽ lúc đấy tôi nhầm lẫn qua (NH4)2SO4, sẽ tăng tủa nếu tăng độ bão hòa.
Chúc vui!
Thứ nhất tôi chỉ dùng ví dụ để ví von khái niệm hòa tan và kết tủa theo kiểu "giảm độ ion dung môi" vì yếu tố kết tủa này khác với kiểu kết tủa trong Hóa học kiểu chất A hay chất B không tan thì nó kết tủa. Ở đây protein hoặc DNA vốn tan trong nước với một lượng nào đó, nếu tăng độ muối chúng sẽ tan nhiều hơn nữa, nếu cho các chất cạnh tranh nước với chúng thì chúng yếu hơn sẽ bị lấy bớt nước và bị kết tủa do nước không còn đủ lực giữ nó (tức thêm cồn vào nước chứ không phải thêm nước vào cồn, mặc dù về bản chất nó không khác nhau chỗ nào cả).
Đối với trường hợp cồn 70% và 100% thì tôi nghĩ anh hiểu sai ý tôi ở chỗ, lúc này nước chiếm phần ít nên bản thân nó cũng là chất tan, còn cồn mới chính là dung môi (xem định nghĩa dung môi trong sách Hóa). Một chất tan trong dung môi cồn có nghĩa là các phân tử cồn đủ lực giữ nó lơ lửng, nếu không thì chất đó sẽ bị kết tủa "trong dung môi cồn". Còn cái ví dụ cồn 100% tôi chưa bao giờ thử và cũng không rõ kết quả thế nào, nhưng theo lập luận của anh Hải thì có lẽ nó kết tủa yếu hơn cồn 70% bởi không có nước để cạnh tranh với các chất tan trong dung môi cồn, đúng không nhỉ? Còn nếu xem nước là dung môi trong trường hợp này thì nồng độ cồn càng cao kết tủa càng nhiều (mà có lẽ sai). Có lẽ lúc đấy tôi nhầm lẫn qua (NH4)2SO4, sẽ tăng tủa nếu tăng độ bão hòa.
Chúc vui!
Luyện Quốc Hải
Member
Xin chào các bạn
? ?Không ai đúng hoàn toàn và cũng không ai sai hoàn toàn. Vấn đề là qua trao đổi, chúng ta học hỏi được những gì mà thôi. Những ý anh Lương nói rất đáng học hỏi. Có cơ hội chúng ta tiếp tục trao đổi nhé.
? ?
? Câu hỏi này nên cho vào một chủ đề mới.
? ?Không ai đúng hoàn toàn và cũng không ai sai hoàn toàn. Vấn đề là qua trao đổi, chúng ta học hỏi được những gì mà thôi. Những ý anh Lương nói rất đáng học hỏi. Có cơ hội chúng ta tiếp tục trao đổi nhé.
? ?
Hoàng Anh Hoàng said:
? Câu hỏi này nên cho vào một chủ đề mới.
Trịnh Thị Hồng Nhung
Member
Cảm ơn các anh,chị nhiều!!!! 
Cảm giác mình được hỏi và có nhiều người quan tâm, trả lời thật là hạnh phúc!(nhất là khi thấy diễn đàn của “mình” đánh giá 5***** vui quá ? ) ?
Giờ thì em đã bíêt tỉ mỉ về “kết tủa” rồi. đơn giản là nó không tan được thì phải kết tủa
Nhưng mà trình tự tách ADN ( em không quen viết DNA cho lắm - mong các bác thông cảm) của anh Hải là lạ. Có nhiều quy trình tách ADN nhưng em xin được tóm tắt cái quy trình đơn giản mà bọn em đã thực hành như sau:
? ? ?( mẫu vật là gan lợn) ?
1. nghiền nát mẫu vật
2. dùng dung dịch kiềm phá vỡ màng photpholipit của tế bào(cho thêm vào 2v níc)
3. dùng enzim bromelin (trong nước ép dứa) tách protein ra khỏi ADN
4. kết tủa ADN bằng cồn(70 - 90 độ)
Kết quả là ADN không lắng ở dưới đáy mà nổi lơ lửng trong lớp cồn.Các sợi ADN kết thành từng bó màu trắng đục.
Thời gian để ADN kết tủa chỉ khoảng 10 phút.
=> em có một só thắc mắc sau:
-như anh Hải nói thì chỉ thu được những đoạn ADN ngắn( vì ADN tan trong nước nên khi nó bị "chiếm mất chỗ “rơi xuống” chỉ là những đoạn nu nhỏ thôi) nhưng khi em làm thực hành thì thấy các sợi ADN rất dài và nổi trong lớp cồn ( liệu có phải các mẩu ADN dính vào nhau?).
-sự kết tủa theo như mọi người nói chỉ là do “ADN không có chỗ” trong nước ?mà thôi vậy mà sao ADN lại chuyển từ trạng thái không màu sang có màu trắng đục?
- Em làm một thí nghiệm như sau:
Sau khi làm bước 2, đem chia dung dịch làm 2 phần:
Phần1 cho thêm dung dịch triết từ thịt quả dứa(chứa bromelin, nhiều axit hĩu cơ). Phần 2 cho vào dung dịch triết từ lõi trắng của dứa(chứa bromelin cao gấp 8 lần nhưng chưa ít axit hơn).
Kết quả là lượng ADN ở ống một nhiều hơn.
?=> có axit ( hay một chất nào đó) trong dứa tham ra vào quá trình kết tủa ADN không?
Cảm giác mình được hỏi và có nhiều người quan tâm, trả lời thật là hạnh phúc!(nhất là khi thấy diễn đàn của “mình” đánh giá 5***** vui quá ?
) ?Giờ thì em đã bíêt tỉ mỉ về “kết tủa” rồi. đơn giản là nó không tan được thì phải kết tủa
Nhưng mà trình tự tách ADN ( em không quen viết DNA cho lắm - mong các bác thông cảm) của anh Hải là lạ. Có nhiều quy trình tách ADN nhưng em xin được tóm tắt cái quy trình đơn giản mà bọn em đã thực hành như sau:
? ? ?( mẫu vật là gan lợn) ?
1. nghiền nát mẫu vật
2. dùng dung dịch kiềm phá vỡ màng photpholipit của tế bào(cho thêm vào 2v níc)
3. dùng enzim bromelin (trong nước ép dứa) tách protein ra khỏi ADN
4. kết tủa ADN bằng cồn(70 - 90 độ)
Kết quả là ADN không lắng ở dưới đáy mà nổi lơ lửng trong lớp cồn.Các sợi ADN kết thành từng bó màu trắng đục.
Thời gian để ADN kết tủa chỉ khoảng 10 phút.
=> em có một só thắc mắc sau:
-như anh Hải nói thì chỉ thu được những đoạn ADN ngắn( vì ADN tan trong nước nên khi nó bị "chiếm mất chỗ “rơi xuống” chỉ là những đoạn nu nhỏ thôi) nhưng khi em làm thực hành thì thấy các sợi ADN rất dài và nổi trong lớp cồn ( liệu có phải các mẩu ADN dính vào nhau?).
-sự kết tủa theo như mọi người nói chỉ là do “ADN không có chỗ” trong nước ?mà thôi vậy mà sao ADN lại chuyển từ trạng thái không màu sang có màu trắng đục?
- Em làm một thí nghiệm như sau:
Sau khi làm bước 2, đem chia dung dịch làm 2 phần:
Phần1 cho thêm dung dịch triết từ thịt quả dứa(chứa bromelin, nhiều axit hĩu cơ). Phần 2 cho vào dung dịch triết từ lõi trắng của dứa(chứa bromelin cao gấp 8 lần nhưng chưa ít axit hơn).
Kết quả là lượng ADN ở ống một nhiều hơn.
?=> có axit ( hay một chất nào đó) trong dứa tham ra vào quá trình kết tủa ADN không?
Luyện Quốc Hải
Member
Chào cô bé Hồng Nhung (không biết có chiếc răng khiểnh nào ko)
Cô bé ham học hỏi quá, làm bọn anh thở không ra hơi.
Rất tiếc là anh không có nhiều thời gian để giúp em hiểu sâu hơn vấn đề tách chiết DNA. Nhưng em yên tâm, kỹ thuật tách chiết DNA thì quá phổ biến và nhiều người làm. Mọi người ở đây sẽ giúp em.....
Anh chỉ có một góp ý này: Topic này là "ADN có bị kết tủa bởi cồn hay không?"
Nếu Em muốn hỏi về tách chiết DNA thì nên lập một topic khác. Mỗi topic chỉ nên giải quyết một vấn đề....
Chúc cô bé học tốt.
Cô bé ham học hỏi quá, làm bọn anh thở không ra hơi.
Rất tiếc là anh không có nhiều thời gian để giúp em hiểu sâu hơn vấn đề tách chiết DNA. Nhưng em yên tâm, kỹ thuật tách chiết DNA thì quá phổ biến và nhiều người làm. Mọi người ở đây sẽ giúp em.....
Anh chỉ có một góp ý này: Topic này là "ADN có bị kết tủa bởi cồn hay không?"
Nếu Em muốn hỏi về tách chiết DNA thì nên lập một topic khác. Mỗi topic chỉ nên giải quyết một vấn đề....
Chúc cô bé học tốt.
Trịnh Thị Hồng Nhung
Member
Hình như anh Hải khen quá lời rồi. Răng em chỉ khấp khểnh thôi chứ không khểnh đâu
Mong mọi người đọc kỹ bài của em và trả lời hộ em với, bài trên nó cũng có liên quan chút ít đến chủ đề này mà. Những điều trên em đã suy nghĩ từ rất lâu rồi, mọi người giúp em "giải toả" mấy thắc mắc này với
Mong mọi người đọc kỹ bài của em và trả lời hộ em với, bài trên nó cũng có liên quan chút ít đến chủ đề này mà. Những điều trên em đã suy nghĩ từ rất lâu rồi, mọi người giúp em "giải toả" mấy thắc mắc này với
Trịnh Thị Hồng Nhung
Member
kêu gọi mọi người trả lời tha thiết :?
Nguyễn Văn Dân
New member
Trịnh Thị Hồng Nhung said:
Chào các bạn ! Hôm nay mới đăng ký được cái nick xin được mạo muội góp mấy câu trả lời thắc mắc của em Nhung
+ cái bạn nhìn thấy không phải là một sợi DNA dài hay ngắn, có rất nhiều đoạn kết búi với nhau với độ dài ngắn khác nhau (chứ mắt thường em nhìn được phân tử DNA không? Cũng như một sợi tóc thì khó nhìn nhưng một búi tóc chắc nhìn ngon lành, cũng như một sợi tóc bạc ta khó nhìn thấy nhưng vài nghìn sợi là thành tóc hoa râm ngay)
+ DNA không tự nó chuyển từ không màu sang màu trắng đục như bạn nghĩ chủ yếy do kết tủa tăng dần về số lượng từ không nhìn thấy ----> nhìn thấy
+ Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới ?lượng DNA thu được từ kết tủa trạng thái mẫu, phương pháp tách chiết, dung dịch đệm, hóa chất sử dụng để ?tách (muối, acid, ion...)
Muốn rõ chi tiết từng thành phần ảnh hưởng tới quá trình tách chiết DNA em vao link sau: http://library.thinkquest.org/19037/dna_extraction.html
Concobebek51
Member
em chào anh
anh ơi cho em hỏi : Khi tách plasmid ra khỏi Ecoli,sau khi cho sol1, sol 2 , sol 3, Ly tâm thu dịch. Bổ sung thêm dung dịch CI ( Chloroform : Isoamylacohol). Em muốn hỏi bổ sung dung dịch này vào để làm gì ạ?
anh ơi cho em hỏi : Khi tách plasmid ra khỏi Ecoli,sau khi cho sol1, sol 2 , sol 3, Ly tâm thu dịch. Bổ sung thêm dung dịch CI ( Chloroform : Isoamylacohol). Em muốn hỏi bổ sung dung dịch này vào để làm gì ạ?
Concobebek51
Member
Similar threads
-
Adn có tồn tại dưới dạng một mạch không ?
- Started by jackthepink29
- Replies: 2
-
Tại sao ARN có một mạch còn ADN có 2 mạch
- Started by mylove
- Replies: 2
-
Công thức tính số liên kết photphodieste trong ADN- Started by steven19vn
- Replies: 15
-
Links Download sách Công nghệ sinh học phân tử: Nguyên lý và ứng dụng của ADN tái tổ hợp- Started by vanhieu
- Replies: 11
