Kết quả PCR phập phù và thấp

[Trịnh Thành Trung]

Mình cũng không hiểu ý Trung về việc rửa vi khuẩn. Để tách DNA thì bao giờ cũng có bước ly tâm thu tế bào vi khuẩn mà? Sau bước này chỉ còn lại TB vi khuẩn, còn môi trường nuôi cấy là pha lỏng sẽ bị loại bỏ.

He he...... Do mình là cái thằng lười biếng, nên khi đưa vi khuẩn từ ống giống trong tủ -70 độ ra, mình cấy nó lên thạch máu, rồi lấy một khuẩn lạc này, cho vào đệm ATL của kit, tách luôn. (mình không biết cách này đúng hay sai nhưng một số người nói, sau khi khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch thì lại phải cấy tiếp vào môi trường lỏng, overnight, rồi hút 1 ml ra, ly tâm, tách....., mình đã bỏ qua một bước đấy, he he....). Nếu quả thực, mấy thằng vi khuẩn của mình có sinh ra chất ức chế PCR, thì mình vẫn khoái làm bước rửa như trên, đỡ tốn thời gian, đỡ phải chuẩn bị môi trường lỏng, đỡ mất nhiều công sức....

P/S: @ Trang: em thử suy đoán tiếp vì sao hàm lượng ADN trong mẫu cũng cao hơn? (1. vì em cũng từng làm về vấn đề này, 2. Tuy lấy lượng tế bào cho vào tách ( khuẩn lạc) chỉ là xác suất nhưng nhìn chung, các mẫu tách của anh khi rửa thì hàm lượng ADN vẫn cao hơn so sánh vơi không rửa)

 

[Lê Hồng Đức]

Mình đang tách chiết ADN từ eubacteria theo phương pháp DNeasy tissue kit, Qiagen. Sau đó sử dụng cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại một đoạn gen mong muốn. Mình không hiểu sao kết quả PCR rất chán, lúc được, lúc không.

Em làm về phân loại các vi khuẩn (thuộc chi Burkhoderia và em cũng chưa biết được con những con này có sản sinh chất ức chế pư PCR hay không?) phân lập được từ trong đất Việt Nam. Trước khi tách ADN, vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch máu (blood agar). Trước đó, em lấy trực tiếp 1 khuẩn lạc rồi bỏ vào dung dịch ATL buffer của kit.

Mình chưa bao giờ làm việc với Burkholderia cả nên chỉ có thể khuyên bạn chung chung như sau:
- Bạn có chắc QIAGEN DNeasy tissue phù hợp với vi khuẩn của bạn không (đọc hướng dẫn đi kèm kit xem nó có tách được DNA vi khuẩn của bạn không, kích cỡ DNA ra sao, không chắc thì email gọi điện hỏi QIAGEN).
- Gene bạn cần nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid của vi khuẩn?
- Với một vi khuẩn chưa biết (ví dụ phân lập từ đất), để chắc chắn mình không bỏ lỡ DNA nào, bạn có thể tách DNA tổng số một cách thô như sau:

- Cấy vi khuẩn ra đĩa thạch thích hợp, bắt một khuẩn lạc non và cấy qua đêm trong môi trường lỏng thích hợp (10-15 h).
- Cấy chuyển trên môi trường thích hợp (~20 ml).
- Gặt tế bào non (2-3 h), rửa sạch bằng nước cất 2-3 lần.
- Hòa cặn tế bào vào nước cất (~2 ml) rồi đun trên khối nhiệt (heat block) khoảng 15 phút.
- Chia nhỏ và giữ đông (<-20[sup:c42fbf543b]o[/sup:c42fbf543b]C).
- Pha loãng 10-100 lần trước khi PCR.

Chắc tuần sau em bắt đầu thử phương pháp anh gợi ý. Tuy nhiên, anh cho em hỏi thêm một chút kinh nghiệm nữa: - Liệu ta có phải kéo dài cái thời gian nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch (lúc đó, nhiều tế bào vi khuẩn cũng đã đi vào Văn Điển, nó có thể để lại các đoạn AND free ở bên ngoài)

Nói chung, vi khuẩn mọc trên đĩa thạch không giống với trong môi trường lỏng đâu. Mình sẽ trả lời kỹ hơn vì bây giờ mình đói quá, đi ăn trưa đã

 

[Trịnh Thành Trung]

Xin đón nhận tất cả các lời chỉ dẫn của anh. Cám ơn anh rất nhiều.

Mình chưa bao giờ làm việc với Burkholderia cả nên chỉ có thể khuyên bạn chung chung như sau:
- Bạn có chắc QIAGEN DNeasy tissue phù hợp với vi khuẩn của bạn không (đọc hướng dẫn đi kèm kit xem nó có tách được DNA vi khuẩn của bạn không, kích cỡ DNA ra sao, không chắc thì email gọi điện hỏi QIAGEN).
- Gene bạn cần nằm trên nhiễm sắc thể hay plasmid của vi khuẩn?

Cái này thì ổn rồi anh à, không có gì phải bàn cãi nữa (loại kit mới của QIAGEN nó ứng dụng phổ biến trên nhiều đối tượng lắm), Gene em cần khuyếch đại lằm trên NST.

Pha loãng 10-100 lần trước khi PCR.

Theo kinh nghiệm của anh, anh dùng bao nhiêu ul cái dung dịch pha loãng này (10 or 100 fold?) trong một phản ứng PCR với thể tích là bao nhiêu ul?

Cám ơn anh rất nhiều!

 

[Lê Hồng Đức]

Liệu ta có phải kéo dài cái thời gian nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa thạch (lúc đó, nhiều tế bào vi khuẩn cũng đã đi vào Văn Điển, nó có thể để lại các đoạn AND free ở bên ngoài)

Vi khuẩn trong môi trường lỏng được di chuyển và tiếp xúc tự do với các chất dinh dưỡng (tuy không phải con nào cũng biết bơi nhưng dù sao ta cũng thường lắc khi nuôi), nên mọc nhanh hơn và đồng đều hơn. Thêm nữa, các chất bài tiết cũng tan vào môi trường và không bám trên vỏ vi khuẩn.

Vi khuẩn mọc trên đĩa thạch bị hạn chế về không gian và dinh dưỡng, do đó mọc chậm và không đều. Vi khuẩn ngoài rỉa khuẩn lạc luôn trẻ hơn ở chính giữa, và các chất thải luôn bám trên vỏ vi khuẩn.

Môi trường thạch có lợi thế khi bạn muốn phân lập vi khuẩn, tách khuẩn lạc, hoặc nuôi vi khuẩn lấy sinh khối lớn (ví dụ trong sản xuất trợ sinh [probiotics]). Ngoài ra, các ứng dụng khác đều khuyên bạn cấy chuyển sang môi trường lỏng vì vi khuẩn đều và sạch hơn (đừng có lười).

Để trả lời câu hỏi trên: vi khuẩn già khó phá tế bào hơn nên kéo dài thời gian nuôi cấy không phải là tốt. Các đoạn DNA của tế bào chết để lại thường đứt gãy và có thể mang nhiều đột biến. Tốt nhất là nuôi vi khuẩn trên môi trường lỏng, thời gian ngắn (giữa pha nhân lên [mid-log]), gặt và rửa sạch trước khi phá tế bào.

Mình cũng không hiểu ý Trung về việc rửa vi khuẩn. Để tách DNA thì bao giờ cũng có bước ly tâm thu tế bào vi khuẩn mà? Sau bước này chỉ còn lại TB vi khuẩn, còn môi trường nuôi cấy là pha lỏng sẽ bị loại bỏ.

Mặc dù đã ly tâm, bạn vẫn phải rửa vi khuẩn 2-3 lần bằng PBS (cá nhân mình thích H[sub:48aafed461]2[/sub:48aafed461]O hơn) cho càng sạch càng tôt tồn dư của môi trường và các chất không mong muốn bám trên vỏ vi khuẩn.

 

[Lê Hồng Đức]

Theo kinh nghiệm của anh, anh dùng bao nhiêu ul cái dung dịch pha loãng này (10 or 100 fold?) trong một phản ứng PCR với thể tích là bao nhiêu ul?

Trong trường hợp chứng dương hoạt động tốt (không có vấn đề gì về enzyme, mồi, các đệm và máy PCR), nếu làm PCR với NST hoặc DNA toàn phần cho kết quả âm tính hoặc lên mờ mờ thì 99% là tại nồng độ DNA cao quá, chứ không phải tại độ tinh sạch của DNA.
Bạn thử chạy PCR với 3 nồng độ DNA (không pha, pha loãng 1/10 và 1/100) xem. Mỗi nồng độ DNA lấy 1 ul cho vào phản ứng 50 ul. PCR với NST nên đặt biến tính 95[sup:7816fe913b]o[/sup:7816fe913b]C 15-20 giây để đảm bảo DNA biến tính tốt.
Bạn dùng DNA polymerase gì vậy, của công ty nào?

 

[Trịnh Thành Trung]

Bác nói đúng quá. Khâm phục, khâm phục  

Bạn thử chạy PCR với 3 nồng độ DNA (không pha, pha loãng 1/10 và 1/100) xem. Mỗi nồng độ DNA lấy 1 ul cho vào phản ứng 50 ul.

He he... Em lại phải thử cái này rồi, nhưng không sao, nếu mà kết quả o.k, sẽ rút ngắn được rất nhiều thời gian, công sức, tiền bạc  

Bạn dùng DNA polymerase gì vậy, của công ty nào?

Bác lại có gợi ý gì chăng  :?:  Em dùng cái loại bình thường thôi, Taq DNA polymease. Trước thì dùng của hãng Amersham Biosciences, nay công ty này đổi thành GE healthcare rồi thì phải.



Edited by CXH

 

[Lê Hồng Đức]

Taq (từ Thermus aquaticus) có đặc tính chạy nhanh và không khó tính, nếu hỗn hợp phản ứng có thừa cái này thiếu cái kia chút đỉnh vẫn chạy tốt. Có điều Taq hay mắc lỗi (1 đột biến trên 1-2 kb) nên không thích hợp cho tạo dòng hoặc chạy tìm trình tự. Taq dùng tốt trong chẩn đoán.

Pfu (từ Pyrococcus furiosus) và KOD của Novagen (từ Thermococcus kodakaraensis) có độ trung thực cao (high fidelity [HiFi]) hơn Taq, nhưng hơi khó tính. Theo kinh nghiệm mình, ACCUZYME của BIOLINE là tôt nhất, dễ chạy và HiFi.

Các enzyme DNA polymerase HiFi ngoài hoạt tính sao chép 5'-3' còn có thêm có hoạt tính đọc lỗi 3'-5' mà Taq không có. Amersham (GE Healthcare Life Sciences) có bán FideliTaq đó nếu bạn cần PCR HiFi.



Edited by CXH

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tag (từ Thermus aquaticus) có đặc tính chạy nhanh và không khó tính, nếu hỗn hợp phản ứng có thừa cái này thiếu cái kia chút đỉnh vẫn chạy tốt. Có điều Tag hay mắc lỗi (1 đột biến trên 1-2 kb) nên không thích hợp cho tạo dòng hoặc chạy tìm trình tự. Taq dùng tốt trong chẩn đoán.

em chỉ xin đính chính phát là: tên enzyme viết chính xác là Taq từ Thermus aquaticus chứ ko phải Tag lại mang 1 nghĩa khác trong SHPT.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Xin bổ sung chút. Đối với PCR colony chỉ nên lấy một chút tế bào từ khuẩn lạc, nếu lấy nhiều quá sẽ cho sản phẩm không đặc hiệu.

Thông thường nên dùng PCR colony với những khuẩn lạc có đường kính tối thiểu 1mm. Nếu khuẩn lạc bé quá có thể cấy chuyển khuẩn lạc đó sang đĩa thạch khác, ủ 2h sau đó thực hiện PCR colony.

Với tách DNA bằng xử lý nhiệt thì tùy vào lượng sinh khối sử dụng mà lấy lượng template thích ứng. Nếu dùng 1,5ml môi trường nuôi cấy ở pha log để xử lý nhiệt thì nên dùng 5ul cho PCR.

Bước rửa tế bào cần với tách DNA plasmid. Còn tách DNA genome thường không cần bước này.

 

[Trịnh Thành Trung]

Tag (từ Thermus aquaticus) có đặc tính chạy nhanh và không khó tính, nếu hỗn hợp phản ứng có thừa cái này thiếu cái kia chút đỉnh vẫn chạy tốt.

em chỉ xin đính chính phát là: tên enzyme viết chính xác là Taq từ Thermus aquaticus chứ ko phải Tag lại mang 1 nghĩa khác trong SHPT.

Mèng ơi, cái này những ai làm về SHPT hoặc đã từng đọc sách về SHPT thì phải biết rồi chứ. Thế nên, theo em hiểu thì cũng chẳng cần đính chính lại làm gì. Chắc vì viết vội, bác Đức quên chưa viết thêm chữ 'viết tắt của' ở phía trước 'từ Thermus aquaticus'. Nhưng cái này người đọc có thể hiểu mà.

Với tách DNA bằng xử lý nhiệt thì tùy vào lượng sinh khối sử dụng mà lấy lượng template thích ứng. Nếu dùng 1,5ml môi trường nuôi cấy ở pha log để xử lý nhiệt thì nên dùng 5ul cho PCR.

Cám ơn Hưng rất nhiều, mình sẽ lấy con số này làm tiêu chí cho các phản ứng dò tìm của mình sau này. Thanks alot!

Bước rửa tế bào cần với tách DNA plasmid. Còn tách DNA genome thường không cần bước này.

Cái này chỉ mang tính chất chung chung thôi, với từng đối tượng khác nhau sẽ là khác nhau vì 'bộ máy tiêu hóa' của các loài khác nhau là khác nhau, thế nên 'chất thải' của chúng cũng khác nhau hoàn toàn. Theo mình, khi chưa hiểu nhiều về đối tượng của mình, một người làm cẩn thận thì nên rửa tế bào trước khi tách. Còn nếu muốn làm tắt hơn nữa thì phải có các phép thử để lấy kinh nghiệm. He he....

Thanks!

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tag (từ Thermus aquaticus) có đặc tính chạy nhanh và không khó tính, nếu hỗn hợp phản ứng có thừa cái này thiếu cái kia chút đỉnh vẫn chạy tốt.

em chỉ xin đính chính phát là: tên enzyme viết chính xác là Taq từ Thermus aquaticus chứ ko phải Tag lại mang 1 nghĩa khác trong SHPT.

Mèng ơi, cái này những ai làm về SHPT hoặc đã từng đọc sách về SHPT thì phải biết rồi chứ. Thế nên, theo em hiểu thì cũng chẳng cần đính chính lại làm gì. Chắc vì viết vội, bác Đức quên chưa viết thêm chữ 'viết tắt của' ở phía trước 'từ Thermus aquaticus'. Nhưng cái này người đọc có thể hiểu mà.

Trung ko nhận ra rồi, chữ Taq (cu) là lấy từ aquaticus chứ ko được viết là tag (gờ) thì có nghĩa là những đuôi amino acid được gắn vào protein tái tổ hợp để hỗ trợ việc tinh sạch như His tag, strep tag .v.v Anh viết rõ để ko ai vấp phải lỗi này nữa.

 

[Phạm Thủy Trang]

P/S: @ Trang: em thử suy đoán tiếp vì sao hàm lượng ADN trong mẫu cũng cao hơn? (1. vì em cũng từng làm về vấn đề này, 2. Tuy lấy lượng tế bào cho vào tách ( khuẩn lạc) chỉ là xác suất nhưng nhìn chung, các mẫu tách của anh khi rửa thì hàm lượng ADN vẫn cao hơn so sánh vơi không rửa)

Thực ra khi em la thì độ tinh sạch và nồng độ ADN thu được luôn tỷ lệ nghịch. Tức là nếu dùng biện pháp mạnh để tiêu diệt thằng polysaccharide, chất ức chế PCR thì thằng ADN cũng hi sinh luôn. Ngược lại dùng phương pháp thông thường thì thằng ADN rất nhiều nhưng chạy lại chả lên sản phẩm PCR.
Nhưng trong trường hợp của anh thì còn phải xem loại kit anh dùng là gì. Nếu nó dùng cột (column) (theo em hiểu thì cái cột đấy sẽ giữ ADN lại còn các thằng khác đi qua?) thì có thể giải thích là nếu không rửa tế bào thì các chất trong môi trường sẽ vẫn còn, các chất này có thể cũng có tính chất như ADN và bị giữ lại trên cột và cạnh tranh điểm bám với ADN. Kết quả là sẽ phải có thằng ADN bị đi qua cột và mất đi.
Ngoài ra em cũng chưa nghĩ được cách giải thích nào hợp lý hơn (đặc biệt nếu kit của anh tách theo những phương pháp thông thường không dùng cột)

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Tuy lấy lượng tế bào cho vào tách ( khuẩn lạc) chỉ là xác suất nhưng nhìn chung, các mẫu tách của anh khi rửa thì hàm lượng ADN vẫn cao hơn so sánh vơi không rửa)

Bây giờ mới đọc thấy dòng này. Có vẻ như vô lý vì kiểu gì thì bước rửa cũng làm mất bớt đi tế bào nên lượng DNA không thể cao hơn đuợc.

Vấn đề ở đây là anh dùng phương pháp gì để xác định hàm lượng DNA? Chú ý sai số thiết bị. Chẳng hạn sai số thiết bị là 5ng/ul mà một mẫu anh đo được 200ng, mẫu kia 204ng thì không thể kết luận được.

Tiếp đến là độ sạch của mẫu cũng ảnh hưởng nhiều đến phép đo OD.

Về việc Taq và Tag tôi cũng nghĩ là anh Đức type nhầm nhưng vẫn nên nhắc nhở vì nhiều bạn sinh viên mắc lỗi này lắm (không phải do type nhầm) và giúp người không phải chuyên ngành nắm rõ hơn.

 

[Trịnh Thành Trung]

Trung ko nhận ra rồi, chữ Taq (cu) là lấy từ aquaticus chứ ko được viết là tag (gờ) thì có nghĩa là những đuôi amino acid được gắn vào protein tái tổ hợp để hỗ trợ việc tinh sạch như His tag, strep tag .v.v Anh viết rõ để ko ai vấp phải lỗi này nữa.

Vâng, vâng, tâm phục, khẩu phục ? . Khổ thế đấy các bác ạ, trong đầu thì nghĩ như thế, đến lúc đánh ra thì nó lại đi một nẻo. Chắc xa vợ, xa con lâu ngày nên bây giờ em bị mắc cái hội chứng gọi là: Trên bảo dưới chẳng chịu nghe. hic hic.....

Bây giờ mới đọc thấy dòng này. Có vẻ như vô lý vì kiểu gì thì bước rửa cũng làm mất bớt đi tế bào nên lượng DNA không thể cao hơn đuợc.

Quả thực, đây có thể là ý kiến chủ quan của mình. Mình lặp lại 6 mẫu rửa từ cái không rửa và cho kết quả PCR âm tính, cả 6 mẫu này đều thu được lượng DNA cao hơn. Thậm chí, có những mẫu, hàm lượng ADN cao gần gấp 2 lần 'choáng váng'.

Thực ra, đối với tế bào vi khuẩn thông thường (một số loại nhỏ li ti thì mình không biết), bác cứ ly tâm 8000rpm trong 5 phút, đảm bảo có bói cũng khó ra được con vi khuẩn nào trong dịch nổi (trừ khi con vi khuẩn của bác sinh nội bào tử, thì em cũng xin chắp 2 tay vái nó 6 vái)

Để giải thích cho cái hiện tượng trên, mình xin đưa ra 2 ý kiến chủ quan của mình. Mời các bác xem và thỉnh giáo:

1. Những chất bám trên bề mặt của vi khuẩn có thể giúp cho vi khuẩn chống lại được đệm và nhiệt độ phá tế bào, vì thế, lượng DNA giải thoát ra ngoài ít hơn.

2. Các chất ngoại bào cũng có thể tương tác với các chất trong đệm phá tế bào, vì thế, giảm hiệu suất phá của đệm.

Xin hết!

 

[Lê Hồng Đức]

Đúng là mình đánh nhầm 2 phát đầu tiên Taq thành Tag, cảm ơn các bạn đã chỉ ra và vô cùng xin lỗi các bạn đã tốn thời gian thảo luận. Không hiểu sao mình không thể sửa được, có mod nào sửa hộ mình cái. Cám ơn nhiều nhiều.

@ Trung: Đồng ý là 8000 vòng/phút trong 5 phút đủ để lắng cặn hầu hết các vi khuẩn và cả bào tử, nhưng li tâm rửa vài lần cũng có thể mất vi khuẩn lúc đổ/hút bỏ dịch nổi.

Đệm phá tế bào vi khuẩn phần lớn chứa SDS và NaOH. Bạn nào ở nơi có mùa đông lạnh, SDS có thể tự nhiên tủa. Cách tốt nhất là bỏ đệm chứa SDS vào tủ ấm 30-37[sup:52b0dcf531]o[/sup:52b0dcf531]C cho SDS đảm bảo tan. Nếu cặn vi khuẩn còn chứa nhiều muối quá, các ion kim loại nhất là Ca[sup:52b0dcf531]2+[/sup:52b0dcf531] và Mg[sup:52b0dcf531]2+[/sup:52b0dcf531] có thể tủa mất OH[sup:52b0dcf531]-[/sup:52b0dcf531] trong đệm li giải. Các ion này thường có mặt trên vỏ vi khuẩn.

Gợi ý: cho thêm EDTA vào đệm li giải (0.5-1 mM). EDTA bắt các ion kim loại này rất tốt. Đề phòng: EDTA ảnh hưởng đến PCR (bắt mất Mg[sup:52b0dcf531]2+[/sup:52b0dcf531] của DNA polymerase) nên chú ý rửa cột chứa DNA thật kỹ. Kit bảo rửa 2 lần thì nhớ rửa 2 lần, không được ăn bớt. Ngoài ra, đệm rửa DNA chứa phần lớn là ethanol, nó có thể làm biến tính hoặc ức chế DNA polymerase (mặc dù hãn hữu vì nồng độ thấp, tuy nhiên cứ đề phòng là hơn). Cho nên, sau 2 bước rửa, cần li tâm cột (không có đệm gì) khoảng 1 phút để cho cột không còn ethanol trước khi thôi DNA bằng H[sub:52b0dcf531]2[/sub:52b0dcf531]O (không hiểu sao mình không tin đệm thôi của kit).

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Thực ra, đối với tế bào vi khuẩn thông thường (một số loại nhỏ li ti thì mình không biết), bác cứ ly tâm 8000rpm trong 5 phút, đảm bảo có bói cũng khó ra được con vi khuẩn nào trong dịch nổi (trừ khi con vi khuẩn của bác sinh nội bào tử, thì em cũng xin chắp 2 tay vái nó 6 vái)

Bạn đã bao giờ làm theo protocol này, sau đó đổ dịch nổi sang ống mới rồi dùng dịch nổi này gạt trên đĩa chưa mà kết luận vậy?

 

[Trịnh Thành Trung]

Thực ra, đối với tế bào vi khuẩn thông thường (một số loại nhỏ li ti thì mình không biết), bác cứ ly tâm 8000rpm trong 5 phút, đảm bảo có bói cũng khó ra được con vi khuẩn nào trong dịch nổi (trừ khi con vi khuẩn của bác sinh nội bào tử, thì em cũng xin chắp 2 tay vái nó 6 vái)

Bạn đã bao giờ làm theo protocol này, sau đó đổ dịch nổi sang ống mới rồi dùng dịch nổi này gạt trên đĩa chưa mà kết luận vậy?

Làm rồi, ngon lắm bác ạ.

Và mình tiến hành trên đối tượng sau với các thao tác sau:

- Các vi khuẩn trong chi Burkhoderia, mấy con vi khuẩn này to, hình que và không sinh nội bào tử
- Phải nhẹ nhàng khi lấy mẫu từ trong máy li tâm ra
- Lúc pipet, thì cố gắng đừng động, chọc vào cái pellet.

Mình đã từng làm 2 thì nghiệm song song và thực hiện bước rửa 3 lần, kết thúc, cái CFU cũng không khác nhau là nhiều trong cùng một độ pha loãng.

P/S: Đừng đổ dịch nổi ra nhé, dùng pipet mà hút.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Làm rồi, ngon lắm bác ạ.

Và mình tiến hành trên đối tượng sau với các thao tác sau:

- Các vi khuẩn trong chi Burkhoderia, mấy con vi khuẩn này to, hình que và không sinh nội bào tử
- Phải nhẹ nhàng khi lấy mẫu từ trong máy li tâm ra
- Lúc pipet, thì cố gắng đừng động, chọc vào cái pellet.

Mình đã từng làm 2 thì nghiệm song song và thực hiện bước rửa 3 lần, kết thúc, cái CFU cũng không khác nhau là nhiều trong cùng một độ pha loãng.

Úi trời, bạn phải làm với cái dịch nổi chứ. Còn làm với pellet thì không nói lên gì cả đâu.

P/S: Đừng đổ dịch nổi ra nhé, dùng pipet mà hút.

Hì, tôi thì lại thích dùng cách đổ ra hơn. Mất một chút vi khuẩn chẳng ảnh hưởng gì ?nhiều. Nhưng thử nghĩ khi bạn làm cùng lúc vài chục mẫu mà dùng pipet hút thì vừa lâu vừa tốn đầu tip.

 

[Trịnh Thành Trung]

Mèng ơi
Tôi cũng đến bó tay với bạn mất, chẳng hiểu bạn đã làm thực nghiệm về cái này chưa hay là bạn cố tình vặn Tôi để cho Tôi thành sai (Vâng, nếu vậy, Tôi xin nhận với riêng bạn là tôi sai. Thế là bạn đã thích chưa nào?). Vặn vẹo ác quá, ac ac ac....

Hì, tôi thì lại thích dùng cách đổ ra hơn. Mất một chút vi khuẩn chẳng ảnh hưởng gì ?nhiều. Nhưng thử nghĩ khi bạn làm cùng lúc vài chục mẫu mà dùng pipet hút thì vừa lâu vừa tốn đầu tip.

Vì đơn giản là bạn làm trên đôi tượng 'người chén vi khuẩn', còn Tôi thì làm trên đối tượng 'vi khuẩn chén người', vì vậy, phải tránh hết những hậu quả khôn lường có thể xảy ra khi dùng phương pháp đổ.

Tóm lại: bạn có tin vào bước rửa hay không thì tùy bạn. Với Tôi thì Tôi tin lắm rồi.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Tôi nghĩ mình có thể dừng tranh luận với bạn về vấn đề này ở đây.

Chúc thành công.