Nguyên nhân khiến sản phẩm PCR ở những chu kỳ cuối không tăng theo hàm mũ?

[Nguyễn Xuân Hưng]

Trong đoạn trích dẫn ở trên, tôi đồng ý với tác giả là khi sản phẩm PCR tăng lên thì số phân tử các sợi đơn của sản phẩm PCR tự gắn lại với nhau sẽ tăng lên. Tuy nhiên, từ kết luận này không thể đương nhiên suy ra: số phân tử sản phẩm PCR được gắn mồi sẽ giảm đi. Điều này có nghĩa là không kết luận được tốc độ phản ứng giảm, hay không giải thích được giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR.

Tác giả suy luận không sai. Template dài hơn primer --> Tm của template (vi du la 55oC) cao hơn Tm của primer (vi du 50oC) --> tại 55oC các template đã có thể gắn với nhau, tới 50oC thì ít primer có thể truy cập tới template hơn.

Vậy vì sao điều này không xảy ra ngay từ đầu, mà phải đến khi tỷ lệ primer/sản phẩm giảm? Khi tỷ lệ này cao, tức rất nhiều primer/sản phẩm --> template khó gặp nhau, nhưng lại dễ gặp primer hơn để mà bắt cặp. Khi tỷ lệ này giảm --> các template dễ gặp nhau để bắt cặp hơn.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Bạn nào có thể giúp tôi hiểu rõ hơn tại sao nồng độ cao của ADN nói chung lại ức chế hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR.

Về cơ bản, DNA polymerase có 3 hoạt tính: (i) Polymerase, 3'-5' exonuclease và 5'-3' exonuclease. Cả 3 hoạt tính đều có thể hoạt động không cần primer và không đặc hiệu với template nào (vì vậy mới có đất để ứng dụng klenow fragment).

Giải thích cho điều trên có 2 khả năng (dùng từ ức chế có vẻ không hợp lý lắm)

1. Khi nồng độ DNA không phải template tăng --> DNA polymerase khó tiếp cận đến template thực hơn vì bị các DNA ngoại lai cản trở.

2. DNA polymerase có thể dùng DNA ngoại lai cho các hoạt tính ko cần primer của nó --> bị chếm dụng --> số DNA polymerase được sử dụng để khuếch đại template thực giảm.

 

[Ho Huu Tho]

- Phần trích dẫn bài báo của Peter Kainz của anh Hiếu chỉ ra: ADN nói chung ức chế hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR. Như vậy, sản phẩm PCR không chỉ là cơ chất của enzym DNA polymerase ở chu kỳ kế tiếp mà còn là chất ức chế enzym này. Nồng độ ADN tăng đến ngưỡng nhất định thì sẽ ức chế hoàn toàn hoạt động của enzym, nên mặc dù nồng độ cơ chất tăng lên thì vẫn không có sản phẩm tạo thành. Điều này có thể giải thích được sự thay đổi sang giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR.
Bạn nào có thể giúp tôi hiểu rõ hơn tại sao nồng độ cao của ADN nói chung lại ức chế hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR.

Giải thích cho điều trên có 2 khả năng (dùng từ ức chế có vẻ không hợp lý lắm)

1. Khi nồng độ DNA không phải template tăng --> DNA polymerase khó tiếp cận đến template thực hơn vì bị các DNA ngoại lai cản trở.

2. DNA polymerase có thể dùng DNA ngoại lai cho các hoạt tính ko cần primer của nó --> bị chếm dụng --> số DNA polymerase được sử dụng để khuếch đại template thực giảm.

Vậy theo anh Hưng, nếu không có ADN ngoại lai trong phản ứng PCR, mà chỉ có template tăng lên thôi thì phản ứng PCR có chuyển từ giai đoạn hàm mũ sang giai đoạn bão hòa không, và bằng cách nào?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Vậy theo anh Hưng, nếu không có ADN ngoại lai trong phản ứng PCR, mà chỉ có template tăng lên thôi thì phản ứng PCR có chuyển từ giai đoạn hàm mũ sang giai đoạn bão hòa không, và bằng cách nào?

Em tưởng vấn đề này mọi người đã thảo luận từ trên rồi? (em không đọc các bài trước). Tất nhiên là không có DNA ngoại lai thì vẫn có giai đoạn bão hòa. Ai làm real-time PCR rồi thì thấy rõ nhất. Thông thường trong real-time PCR có sử dụng standard là 1 vector chứa trình tự template đã biết nên có thể chắc chắn là mẫu standard không chứa DNA ngoại lai, nhưng sẽ vẫn thấy rõ giai đoạn bão hòa.

Cho dù không có DNA ngoại lai, thì khi nồng độ template quá cao cũng sẽ dẫn đến rất nhiều chuyện phát sinh như đã đề cập 1 phần ở các bài trên: template dễ gặp nhau để tạo thành dimer hơn, tỷ lệ số phân tử DNA polymerase/số phân tử template giảm, tỷ lệ số phân tử primer/số phân tử template giảm... Những yếu tố này đều góp phần dẫn tới pha plateau.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Vậy theo anh Hưng, nếu không có ADN ngoại lai trong phản ứng PCR, mà chỉ có template tăng lên thôi thì phản ứng PCR có chuyển từ giai đoạn hàm mũ sang giai đoạn bão hòa không, và bằng cách nào?

Hoặc bác Thọ có thể thử check bằng PCR thông thường này: lấy 1 vector hoặc sản phẩm PCR có sẵn dùng làm template cho phản ứng PCR (--> loại bỏ yếu tố ngoại lai) với primer đặc hiệu. Mix 10 ống phản ứng giống hệt nhau, đặt chu trình nhiệt 40 chu kỳ. Bắt đầu từ chu kỳ 30, sau mỗi chu kỳ mở máy lấy ra 1 ống. Cuối cùng điện di 10 ống sản phẩm xem sự khác biệt thế nào.

 

[Ho Huu Tho]

Có lẽ nên đưa ra nồng độ cụ thể của các thành phần chủ yếu trong một phản ứng PCR thông thường, để dễ hiểu hơn câu trả lời của mọi người:

- dNTP --------------- 200 μM mỗi loại A,T,G,C
- primer xuôi ---------1 μM
- primer ngược -------1 μM
- DNA Polymerase --- 0.024 U/μl

Số lượng tương ứng trong mỗi phản ứng thể tích 10 ul được tính như sau:
- dNTP ----------------2 nmol mỗi loại A,T,G,C
- primer xuôi ---------10 pmol
- primer ngược -------10 pmol
- DNA Polymerase ---? ...

...Thêm một giả sử nữa là khối lượng sản phẩm PCR tối đa thu được là 200 ng (cái này theo ước lượng của anh Lương ở một topic khác). Khối lượng này đổi ra đơn vị mol là: 200 (ng)/62.000 (g/mol) = 3.2 pmol.

Từ đây có thể thấy: khi đến giai đoạn bão hòa thì số phân tử primer được sử dụng chỉ là 3.2 pmol, chiếm 30% tổng số primer có trong phản ứng. Nói cách khác, số lượng primer còn dư chiếm 70% khi phản ứng ở giai đoạn bão hòa. Như vậy tỉ lệ primer/template giảm chủ yếu là do nồng độ của template tăng lên, chứ bản thân nồng độ primer giảm không nhiều.

Trong đoạn trích dẫn ở trên, tôi đồng ý với tác giả là khi sản phẩm PCR tăng lên thì số phân tử các sợi đơn của sản phẩm PCR tự gắn lại với nhau sẽ tăng lên. Tuy nhiên, từ kết luận này không thể đương nhiên suy ra: số phân tử sản phẩm PCR được gắn mồi sẽ giảm đi. Điều này có nghĩa là không kết luận được tốc độ phản ứng giảm, hay không giải thích được giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR.

Tác giả suy luận không sai. Template dài hơn primer --> Tm của template (vi du la 55oC) cao hơn Tm của primer (vi du 50oC) --> tại 55oC các template đã có thể gắn với nhau, tới 50oC thì ít primer có thể truy cập tới template hơn.

Vậy vì sao điều này không xảy ra ngay từ đầu, mà phải đến khi tỷ lệ primer/sản phẩm giảm? Khi tỷ lệ này cao, tức rất nhiều primer/sản phẩm --> template khó gặp nhau, nhưng lại dễ gặp primer hơn để mà bắt cặp. Khi tỷ lệ này giảm --> các template dễ gặp nhau để bắt cặp hơn.

Để mình họa cho ý kiến của anh Hưng, tôi thử sử dụng trường hợp cụ thể về bão hòa của phản ứng PCR đã được giả định như ở trên:
- Lúc bão hòa có số các phân tử của các loại như sau:
1. Primer xuôi: 6.8 pmol
2. Primer ngược: 6.8 pmol
3. Sản phẩm PCR (mỗi sản phẩm PCR sẽ có một sợi xuôi, một sợi ngược): 3.2 pmol
- Một số chu kỳ trước đó sẽ là giai đoạn hàm mũ. Nếu tại một chu kỳ nào đó trước giai đoạn bão hòa có số sản phẩm PCR bằng 1/2 số trên, thì ta có số các phân tử của các loại như sau:
1. Primer xuôi: 8.4 pmol
2. Primer ngược: 8.4 pmol
3. Sản phẩm PCR (mỗi sản phẩm PCR sẽ có một sợi xuôi, một sợi ngược): 1.6 pmol
Câu hỏi đặt ra là trong hai trường hợp trên, khi phản ứng PCR cùng hạ nhiệt độ từ 95 độ về nhiệt độ gắn mồi (ví dụ: 50 độ) thì số sản phẩm PCR được gắn mồi trong trường hợp nào nhiều hơn?

 

[meopoka]

có một số nguyên nhân sau:
1. nồng độ ADN ban đầu cao
2. Các thành phần phản ứng chưa cân bằng theo đúng tỷ lệ
3. Các thành phần phản ứng giảm độ nhạy khi trải qua nhiều chu trình nhiệt

 

[Ho Huu Tho]

Tác giả suy luận không sai. Template dài hơn primer --> Tm của template (vi du la 55oC) cao hơn Tm của primer (vi du 50oC) --> tại 55oC các template đã có thể gắn với nhau, tới 50oC thì ít primer có thể truy cập tới template hơn.

Vậy vì sao điều này không xảy ra ngay từ đầu, mà phải đến khi tỷ lệ primer/sản phẩm giảm? Khi tỷ lệ này cao, tức rất nhiều primer/sản phẩm --> template khó gặp nhau, nhưng lại dễ gặp primer hơn để mà bắt cặp. Khi tỷ lệ này giảm --> các template dễ gặp nhau để bắt cặp hơn.

Để mình họa cho ý kiến của anh Hưng, tôi thử sử dụng trường hợp cụ thể về bão hòa của phản ứng PCR đã được giả định như ở trên:
- Lúc bão hòa có số các phân tử của các loại như sau:
1. Primer xuôi: 6.8 pmol
2. Primer ngược: 6.8 pmol
3. Sản phẩm PCR (mỗi sản phẩm PCR sẽ có một sợi xuôi, một sợi ngược): 3.2 pmol
- Một số chu kỳ trước đó sẽ là giai đoạn hàm mũ. Nếu tại một chu kỳ nào đó trước giai đoạn bão hòa có số sản phẩm PCR bằng 1/2 số trên, thì ta có số các phân tử của các loại như sau:
1. Primer xuôi: 8.4 pmol
2. Primer ngược: 8.4 pmol
3. Sản phẩm PCR (mỗi sản phẩm PCR sẽ có một sợi xuôi, một sợi ngược): 1.6 pmol
Câu hỏi đặt ra là trong hai trường hợp trên, khi phản ứng PCR cùng hạ nhiệt độ từ 95 độ về nhiệt độ gắn mồi (ví dụ: 50 độ) thì số sản phẩm PCR được gắn mồi trong trường hợp nào nhiều hơn?

Nếu so sánh với trường hợp chưa bão hòa giả định như ở trên thì lúc bão hòa có nồng độ sản phẩm PCR gấp đôi, điều này có nghĩa là xác suất để các sợi đơn của sản pham PCR re-anneal lại với nhau tăng gấp 4 lần. Trong khi đó, nồng độ primer giảm 8.4/6.8 lần so với lúc chưa bão hòa nên xác xuất để các sợi đơn được gắn mồi chỉ tăng 28.4/6.8) = 1.6 lần. Vậy khi tăng nồng độ của sản phẩm PCR thì tỉ lệ re-anneal của sản phẩm PCR sẽ tăng nhiều hơn so với mức tăng của tỉ lệ sản phẩm PCR được gắn mồi.

Tuy nhiên, để trả lời câu hỏi trường hợp nào (bão hòa hay chưa bão hòa) có số sản phẩm PCR được gắn mồi nhiều hơn, thì tôi nghĩ (không chắc) có thể giải quyết theo kiểu động học cân bằng theo như ý kiến của bạn Thảo và một số bạn ở một topic khác. Nếu giải quyết được theo hướng đó thì có vẻ như lúc bão hòa có nhiều sản phẩm PCR được gắn mồi hơn lúc chưa bão hòa. Nếu đúng như vậy thì tốc độ phản ứng giảm ở giai đoạn bão hòa không liên quan đến hiện tượng gắn mồi hay tỉ lệ template/primer?

 

[Ho Huu Tho]

Vấn đề em thắc mắc là, nếu như còn [PA'] thì đến khi kết thúc chu kỳ, nó lại thành AA' đúng không ạ? Tức là các con số vẫn thay đổi, hệ vẫn chưa cân bằng

Tôi thấy thắc mắc này của anh Thành rất hợp lý:
Một khi PA' được tạo thành thì enzym (nếu còn hoạt tính) sẽ kéo dài đoạn mồi P, dẫn tới biến đổi phức hợp PA' và cuối cùng sẽ biến đổi PA' thành AA'. Hơn nữa, bình thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hơn Tm của mồi khoảng 5-10°C, nên ở nhiệt độ gắn mồi thì hằng số cân bằng ( K = [PA']/[P][A']) khá cao. Điều này có nghĩa là: một khi mồi P đã gắn được vào sợi A' của sản phẩm PCR để tạo thành PA' thì khả năng để hai sợi tách ra rất thấp. Vậy quá trình hạ nhiệt độ từ 95°C xuống nhiệt độ gắn mồi thì mồi P sẽ kết hợp với sợi đơn A' của sản phẩm PCR (miễn là trong dung dịch sợi đơn A' chưa kết hợp với sợi bổ sung A để chuyển thành sợi kép), chứ sản phẩm PA' sẽ hầu như không phân ly nếu enzym DNA polymerase còn hoạt tính mạnh. Nếu vậy thì quá trình gắn mồi này không còn là quá trình thuận nghịch nữa và không thể giải quyết theo hướng động học cân bằng?

 

[matruongln]

Hệ sinh thái

Các gen, các loài và các thành phần khác của đa dạng sinh học trên thế giới không thể bị tách rời khỏi các quá trình của sự sống mà các thành phần này tạo ra giữa chúng, chẳng hạn sự sinh sản, sự tiêu thụ, sự tiến hoá. Cùng với đa dạng sinh học (các yếu tố của sự sống), các quá trình sinh thái học (những tương tác giữa các loài cũng như giữa loài với môi trường của chúng) tạo nên lớp vỏ sự sống của trái đất - sinh quyển.

Đối với các cá thể và quần thể sinh vật, những tương tác này bao gồm các cơ chế như: vật dữ - con mồi, cạnh tranh, ký sinh và hỗ sinh (trong khi các quần xã thay đổi trong quá trình tiến hoá). Một dạng tương tác khác, loài tác động lên môi trường vật lý của chúng - thông qua, hoặc là quá trình tạo ra sản phẩm sơ cấp (sự chuyển hoá năng lượng mặt trời thành sinh khối nhờ quá trình quang hợp), hoặc là quá trình phân huỷ (phá vỡ các hợp chất hữu cơ nhờ các sinh vật trong môi trường), hoặc là sự tham gia vào chu trình sinh địa hoá (sự vận chuyển chất dinh dưỡng, nước và các yếu tố hoá học thông qua các sinh vật và môi trường vật lý).