Nguyên nhân khiến sản phẩm PCR ở những chu kỳ cuối không tăng theo hàm mũ?

[Ho Huu Tho]

Mình có câu hỏi này về phản ứng PCR, những bạn nào đã từng học, làm về PCR cùng cho ý kiến giúp.
Câu hỏi:
Những nguyên nhân nào sau đây khiến sản phẩm PCR ở những chu kỳ cuối không tăng theo hàm mũ như giai đoạn trước đó nữa, mà tốc độ tăng giảm dần hoặc không tăng:
A. Enzym DNA polymerase bị bất hoạt sau nhiều chu kỳ PCR.
B. Hết primer
C. Hết dNTP
D. Nguyên nhân khác (nếu có thể hãy nêu rõ)

 

[Cao Xuân Hiếu]

Mình có câu hỏi này về phản ứng PCR, những bạn nào đã từng học, làm về PCR cùng cho ý kiến giúp.
Câu hỏi:
Những nguyên nhân nào sau đây khiến sản phẩm PCR ở những chu kỳ cuối không tăng theo hàm mũ như giai đoạn trước đó nữa, mà tốc độ tăng giảm dần hoặc không tăng:
A. Enzym DNA polymerase bị bất hoạt sau nhiều chu kỳ PCR.
B. Hết primer
C. Hết dNTP
D. Nguyên nhân khác (nếu có thể hãy nêu rõ)

Nồng độ DNA quá cao. Nếu có thể pha loãng phản ứng ra thì có thể vẫn tăng theo hàm số mũ cho đến khi hết 1 nguyên liệu nào đó.

 

[Đinh Duy Thành]

Mình có câu hỏi này về phản ứng PCR, những bạn nào đã từng học, làm về PCR cùng cho ý kiến giúp.
Câu hỏi:
Những nguyên nhân nào sau đây khiến sản phẩm PCR ở những chu kỳ cuối không tăng theo hàm mũ như giai đoạn trước đó nữa, mà tốc độ tăng giảm dần hoặc không tăng:
A. Enzym DNA polymerase bị bất hoạt sau nhiều chu kỳ PCR.
B. Hết primer
C. Hết dNTP
D. Nguyên nhân khác (nếu có thể hãy nêu rõ)

Như hồi xưa em học Hóa thì tốc độ phản ứng phụ thuộc nồng độ đầu vào, khi nồng độ chất đầu vào giảm đi thì tần suất "va chạm" giữa chúng cũng giảm theo, dẫn đến giảm tốc độ phản ứng.

Trong phản ứng PCR, lúc đầu nồng độ template DNA rất thấp, nồng độ primer, dNTP rất cao. Sau đó nồng độ DNA tăng dần, dNTP và primer giảm dần. Em không biết vẽ đồ thị lên đây nhưng (mặc dù không chính xác lắm) các bác cứ tưởng tượng:
templDNA chạy từ dưới lên, dNTP và primer chạy từ trên xuống, thằng nào thấp hơn sẽ quyết định tốc độ phản ứng. Lúc đầu tốc độ phản ứng phụ thuộc templDNA nên nó tăng lên (theo hàm mũ). Đến khi hai đường cắt nhau thì tốc độ cân bằng, sau đó giảm dần (do dNTP và primer lúc này đã đi xuống dưới, nhớ là thằng nào thấp hơn thì quy định tốc độ phản ứng). Một điều nữa cần nhớ là tốc độ phản ứng giảm nhưng sản phẩm thì vẫn tăng, chỉ là tăng chậm hơn thôi.

DNA pol thì hơi khác, nó không tăng không giảm theo thời gian. Tuy nhiên khi nồng độ templDNA tăng lên, xác suất để bắt gặp phân tử polymerase tự do lại giảm đi. Tốc độ phản ứng vẫn tăng nhưng chậm dần rồi đạt giới hạn khi tất cả pol đều được sử dụng trong mỗi chu kỳ. (Giả định dNTP và primer được cung cấp liên tục thì ta có thể thấy đường cong sản phẩm chuyển dần từ log về lin khi enzyme được sử dụng hết).

Tổng hợp lại, với điều chỉnh hệ số thích hợp, có thể vẽ (gần đúng) đồ thị tốc độ phản ứng PCR phụ thuộc nồng độ templDNA, dNTP, primer và DNA pol ban đầu. Vẫn nhớ rằng thằng nào thấp hơn sẽ quy định tốc độ phản ứng. Ta sẽ thấy tùy theo thông số đầu vào mà lần lượt từng thằng sẽ trở thành nhân tố giới hạn đó ^_^

Bác nào định dạy học thì có thể dùng đồ thị đấy để giải thích rất nhiều thứ ^_^

 

[Ho Huu Tho]

Cảm ơn ý kiến của anh Hiếu và anh Thành, hai anh có thể giải thích thêm cho tôi chỗ này được không?

Nồng độ DNA quá cao. Nếu có thể pha loãng phản ứng ra thì có thể vẫn tăng theo hàm số mũ cho đến khi hết 1 nguyên liệu nào đó.

Anh Hiếu có thể cho biết cơ chế tại sao nồng độ DNA quá cao lại làm giảm tốc độ phản ứng PCR được không?

Như hồi xưa em học Hóa thì tốc độ phản ứng phụ thuộc nồng độ đầu vào, khi nồng độ chất đầu vào giảm đi thì tần suất "va chạm" giữa chúng cũng giảm theo, dẫn đến giảm tốc độ phản ứng.
Trong phản ứng PCR, lúc đầu nồng độ template DNA rất thấp, nồng độ primer, dNTP rất cao. Sau đó nồng độ DNA tăng dần, dNTP và primer giảm dần.

Theo anh Thành thì trong giai đoạn gắn mồi (annealing), tôi có thể coi phản ứng PCR là phản ứng kết hợp giữa primer với template hay không? Nếu có thể coi như vậy thì tôi thấy nồng độ của template tăng chính là nồng độ của chất đầu vào tăng, như vậy sẽ tăng sự va chạm giữa primer với template, dẫn đến tăng tốc độ phản ứng chứ nhỉ?

 

[Đinh Duy Thành]

Theo anh Thành thì trong giai đoạn gắn mồi (annealing), tôi có thể coi phản ứng PCR là phản ứng kết hợp giữa primer với template hay không? Nếu có thể coi như vậy thì tôi thấy nồng độ của template tăng chính là nồng độ của chất đầu vào tăng, như vậy sẽ tăng sự va chạm giữa primer với template, dẫn đến tăng tốc độ phản ứng chứ nhỉ?

Template cũng là chất đầu vào, bác đọc lại đoạn này nhé:

templDNA chạy từ dưới lên, dNTP và primer chạy từ trên xuống, thằng nào thấp hơn sẽ quyết định tốc độ phản ứng. Lúc đầu tốc độ phản ứng phụ thuộc templDNA nên nó tăng lên (theo hàm mũ). Đến khi hai đường cắt nhau thì tốc độ cân bằng, sau đó giảm dần (do dNTP và primer lúc này đã đi xuống dưới, nhớ là thằng nào thấp hơn thì quy định tốc độ phản ứng).

Trong giai đoạn đầu của phản ứng thì nó xảy ra đúng như anh nói. Nhưng đến khi nồng độ template tăng lên, dNTP và primer giảm xuống (mất đi một lượng đúng bằng chỗ template tăng lên) thì nồng độ thấp của dNTP và primer trở thành nguyên nhân làm giảm tốc độ phản ứng.

 

[Cao Xuân Hiếu]

The presence of endogenous amplicon DNA accumulated in later PCR cycles was found to inhibit completely the activity of DNA polymerase. ...., a further addition of polymerase significantly improved their function. These results indicate that the main factor contributing to the plateau phase in PCR consists of binding of DNA polymerase to its amplification products.

check it out http://dx.doi.org/10.1016/S0167-4781(00)00200-1

có bạn nào giúp tôi dịch vắn lại bài báo này thì tốt. Tôi sẽ cố gắng hiệu đính.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

hihi. Câu này giống câu mình ra cho học sinh cách đây mấy năm quá.
Nó nằm trong sách này:The basics from background to bench - PCR (M.J. Mc Pherson & S.G Moller.
Nguyên văn (TA) nhé:

The plateau phase is reached as a consequence of changes in the relative
concentrations of certain components of the reaction (Table 2.2). In
particular all the molecules of thermostable polymerase (about 3 × 1010) will be engaged in DNA synthesis. If there are a larger number of product strands than DNA polymerase molecules then not all DNA strands will be used as templates for further DNA synthesis during each cycle and therefore
exponential amplification cannot continue. In addition, as product DNA
accumulates and the ratio of primer to product decreases, there is a greater
tendency for product strands to anneal thus preventing their use as
templates. Since the products are longer than the primers the annealing of
complementary product strands can begin at higher temperatures than for
primer/template annealing therefore product strands can be sequestered
from the reaction. It is likely that some nonspecific products will accumulate.
As the true product becomes less available to act as template, due to
reannealing, any nonspecific products that have been generated will be
present at lower concentrations than the true products and therefore can
provide alternative templates for amplification. These nontarget products
may now accumulate at an exponential rate while the true products will
increase in number more slowly. In some cases, at high product concentrations product strands can anneal to allow self-primed concatameric
products that are longer than the desired product and can appear as a
higher molecular mass smear on an agarose gel. These features are clearly
nonproductive and lead to contamination of the true PCR product with
other fragments

 

[Sunny.50bio]

có một số nguyên nhân sau:
1. nồng độ ADN ban đầu cao
2. Các thành phần phản ứng chưa cân bằng theo đúng tỷ lệ
3. Các thành phần phản ứng giảm độ nhạy khi trải qua nhiều chu trình nhiệt
4...

 

[Ho Huu Tho]

có một số nguyên nhân sau:
1. nồng độ ADN ban đầu cao
2. Các thành phần phản ứng chưa cân bằng theo đúng tỷ lệ
3. Các thành phần phản ứng giảm độ nhạy khi trải qua nhiều chu trình nhiệt
4...

Sunny có thể cho biết thêm mấy ý này được không:
1. Nồng độ ADN ban đầu thấp như thế nào thì sản phẩm PCR liên tục tăng theo hàm mũ?
2. Chưa cân bằng theo đúng tỉ lệ cần được hiểu thế nào, thế nào cân bằng?
3. Thành phần nào giảm độ nhạy và giảm như thế nào qua nhiều chu trình nhiệt?

 

[Ho Huu Tho]

Có lẽ nên đưa ra nồng độ cụ thể của các thành phần chủ yếu trong một phản ứng PCR thông thường, để dễ hiểu hơn câu trả lời của mọi người:

- dNTP --------------- 200 μM mỗi loại A,T,G,C
- primer xuôi ---------1 μM
- primer ngược -------1 μM
- DNA Polymerase --- 0.024 U/μl

Số lượng tương ứng trong mỗi phản ứng thể tích 10 ul được tính như sau:
- dNTP ----------------2 nmol mỗi loại A,T,G,C
- primer xuôi ---------10 pmol
- primer ngược -------10 pmol
- DNA Polymerase ---? (không biết cái này sẽ đổi ra được bao nhiêu phân tử, bạn nào biết tính giúp mình. Nếu không thì cứ giả sử nó là 3x10^10 như bài viết mà anh Lương dẫn ra ở trên)

Để cho dễ hơn, giả sử luôn chiều dài mỗi primer là 20 bp (4A, 4T, 4G, 4C), kích thước sản phẩm PCR là 100 bp, trong trình tự của mỗi sợi có 25 A, 25 T, 25 G, 25 C. Khối lượng phân tử của sản phẩm PCR sẽ là: 62 KDal. Số bản copy của ADN khuôn ban đầu là 1000.

Thêm một giả sử nữa là khối lượng sản phẩm PCR tối đa thu được là 200 ng (cái này theo ước lượng của anh Lương ở một topic khác). Khối lượng này đổi ra đơn vị mol là: 200 (ng)/62.000 (g/mol) = 3.2 pmol.

 

[Ho Huu Tho]

The plateau phase is reached as a consequence of changes in the relative of certain components of the reaction (Table 2.2). In all the molecules of thermostable polymerase (about 3 × 1010) will be engaged in DNA synthesis. If there are a larger number of product strands than DNA polymerase molecules then not all DNA strands will be used as templates for further DNA synthesis during each cycle and therefore amplification cannot continue...

Thử xem xét nguyên nhân đầu tiên được nêu ra ở phần trích dẫn của anh Lương:
Số phân tử sản phẩm PCR là: 3.2 pmol = 1.8x10^12. Số này nhiều hơn khoảng 50 lần so với số phân tử DNA polymerase. Như vậy, dường như đoạn trích trên có lý ở chỗ trong giai đoạn plateau thì không phải mọi sợi ADN đều được dùng để tổng hợp sợi mới.
Tuy nhiên, mình có một ý hơi khác thế này:
- Trong một phản ứng hóa học nói chung thì enzyme giữ vai trò xúc tác. Mà đã là chất xúc tác thì theo mình sau khi xúc tác phản ứng thì nó vẫn còn nguyên và lại tiếp tục xúc tác cho phản ứng khác. Nếu đúng như vậy thì một phân tử enzym có thể xúc tác cho phản ứng của nhiều phân tử.
- Cụ thể ở trường hợp này, ở mỗi chu kỳ phản ứng PCR, một phân tử enzym có thể xúc tác cho sự tổng hợp của nhiều sợi miễn là có đủ thời gian để nó làm việc. Mà mình được biết là các enzym DNA polymerase mới có tốc độ rất nhanh.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn Thọ nên xem phần động học enzyme. Vmax. Ở đây nói đến tốc độ tăng chứ không phải số products tuyệt đối bởi số này sẽ vẫn tăng nhưng không phải hàm mũ nữa.
Thường thì bạn dùng từ 0.25-1ul enzyme. Như vậy chỉ cần số products tăng lên 4 lần so với khi dùng 0.25 ul enzyme thì enzyme đã có thể bão hòa rồi mà. Mà enzyme bị bão hòa thì không có chuyện số products là 2^n nữa.

Dù sao thì cái plateau phase cũng là kết hợp của nhiều yếu tố chứ không phải chỉ mỗi enzyme bị bão hòa.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tôi ko giỏi lắm ở các khoản mô phỏng động học nhưng tôi tin tưởng vào cách sắp xếp thí nghiệm và kết quả thực nghiệm. Những số liệu của Peter Kainz (BBA, 2000) mà tôi gửi link phía trên đã được tôi vắn tắt lại ở bài viết của mình trên VLOS. Mời các bạn đón xem.

Kỹ thuật PCR căn bản

 

[Ho Huu Tho]

Bạn Thọ nên xem phần động học enzyme. Vmax. Ở đây nói đến tốc độ tăng chứ không phải số products tuyệt đối bởi số này sẽ vẫn tăng nhưng không phải hàm mũ nữa.

Có phải ý anh Lương nói đến sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất không ạ: nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ phản ứng tăng, tốc độ phản ứng đạt cực đại ở một nồng độ cơ chất nhất định, nếu tăng nồng độ cơ chất hơn nữa thì tốc độ phản ứng vẫn không tăng.
Như vậy có phải ý của anh Lương là tại plateau phase thì tốc độ phản ứng giữ ở mức cực đại không ạ?

Thường thì bạn dùng từ 0.25-1ul enzyme. Như vậy chỉ cần số products tăng lên 4 lần so với khi dùng 0.25 ul enzyme thì enzyme đã có thể bão hòa rồi mà. Mà enzyme bị bão hòa thì không có chuyện số products là 2^n nữa.

Anh Lương có thể giải thích rõ hơn đoạn này được không ạ, em chưa hiểu ý của anh lắm.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đúng đó bạn Thọ.
Để giải thích Vmax, người ta nói đến turnover rate của enzyme. Tức bao nhiêu cơ chất enzyme có thể làm việc với trong 1 đơn vị thời gian. Giả dụ nồng độ enzyme là cố định, thì tốc độ phản ứng ban đầu sẽ phụ thuộc nồng độ cơ chất (khả năng bắt gặp giữa cơ chất với enzyme), cho đến một lúc tất cả enzyme đều bão hòa (có gặp cũng không làm gì được vì enzyme đang bận làm việc với 1 ptu cơ chất khác) thì có thêm cơ chất vào tốc độ pư cũng không thể thay đổi nữa. Như vậy ta sẽ đạt Vmax tại nồng độ enzyme đó.

Cái ví dụ là để minh họa thực nghiệm: giả dụ ở 0.25 ul enzyme ta có một Vmax, thì khả năng ở 1 ul ta có Vmax khác mà số sp chỉ cần tăng 4 lần là đã đạt tới Vmax đó.

 

[Ho Huu Tho]

Giả dụ nồng độ enzyme là cố định, thì tốc độ phản ứng ban đầu sẽ phụ thuộc nồng độ cơ chất (khả năng bắt gặp giữa cơ chất với enzyme), cho đến một lúc tất cả enzyme đều bão hòa (có gặp cũng không làm gì được vì enzyme đang bận làm việc với 1 ptu cơ chất khác) thì có thêm cơ chất vào tốc độ pư cũng không thể thay đổi nữa. Như vậy ta sẽ đạt Vmax tại nồng độ enzyme đó.

Em có thể hiểu đoạn trên như sau không ạ: Tốc độ phản ứng đạt cực đại trong giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR --> lượng sản phẩm PCR mới tạo thành trong mỗi chu kỳ ở giai đoạn này đạt cực đại. Điều này lại mâu thuẫn và không giải thích được cái giai đoạn "plateau" - "bình nguyên" của phản ứng PCR.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hihi. Ở trên có nhấn mạnh đến "các yếu tố khác" nữa rồi mà. Ví dụ đến một nồng độ nhất định thì reannealing của products sẽ chiếm ưu thế so với bắt cặp với mồi và do đó cũng sẽ không có thêm nhiều products nếu tăng thêm chu kỳ.

Có thể hình dung yếu tố enzyme bão hòa sẽ nằm đâu đó ở gần cuối của exponential phase, rồi sau đó mất cân bằng nồng độ các chất tham gia đóng vai trò chủ đạo trong giai đoạn plateau.

 

[Đinh Duy Thành]

Không biết bác đã quan sát đồ thị của phản ứng real-time PCR chưa ^^ đoạn nó chuyển sang lin (và sau đó là điểm uốn - tốc độ giảm) còn cách đoạn nằm ngang một vài chu kỳ (lâu lắm rồi em không sờ vào máy nên không nhớ chính xác "một vài" là mấy).
Note: Cần chuyển đơn vị trên cả X-axis và Y-axis về dạng linear.

@anh Hiếu: Sau Kainz có tác giả nào sử dụng real-time PCR để đánh giá lại không anh? Cái đó em thấy trực quan hơn, mà nếu chưa có thì đôi khi điều chế bài báo mới được đấy

 

[Ho Huu Tho]

Có thể hình dung yếu tố enzyme bão hòa sẽ nằm đâu đó ở gần cuối của exponential phase, rồi sau đó mất cân bằng nồng độ các chất tham gia đóng vai trò chủ đạo trong giai đoạn plateau.

...Những số liệu của Peter Kainz (BBA, 2000) mà tôi gửi link phía trên đã được tôi vắn tắt lại ở bài viết của mình trên VLOS. Mời các bạn đón xem.

Kỹ thuật PCR căn bản
...Lượng sản phẩm PCR được tổng hợp nên sau mỗi chu kỳ thường theo 1 dạng đường chuẩn gồm 3 giai đoạn: 1) tăng trưởng mũ, 2) tăng tuyến tính, 3) bão hòa (lượng sản phẩm tăng không đáng kể hoặc thậm chí giảm).

...Tuy nhiên, thí nghiệm của Peter Kainz (BBA, 2000) chỉ ra nồng độ DNA nói chung (gồm cả sản phẩm PCR và DNA lẫn tạp) và lượng DNA polymearase tự do có mặt là yếu tố chính quyết định điểm bão hòa sản phẩm trong PCR. Khi Kainz tăng nồng độ DNA đầu vào (nhưng giữ nguyên số DNA khuôn thực) bằng cách bổ sung 1 lượng khác nhau (từ 200ng - 2ug) của một đoạn DNA lẫn tạp (kích thước nhỏ hơn kích thước sản phẩm PCR), PCR bị ức chế bởi DNA ngoại lai và có sự phu thuộc rõ ràng vào nồng độ của DNA ban đầu. Bằng cách bổ sung thêm lượng DNA polymearase có mặt trong phản ứng có thể giảm thiểu sự ức chế này (xem hình 1). Điều đó cho thấy hoạt động của DNA polymearase phụ thuộc chặt chẽ vào nồng độ DNA có mặt trong ống thí nghiệm (bất kể là sản phẩm đặc hiệu hay DNA lẫn tạp)...

Tóm tắt lại hai ý ở trên:
- Nếu coi sản phẩm PCR của một chu kỳ là cơ chất của enzym DNA polymerase ở chu kỳ kế tiếp, thì sự bão hòa enzym chỉ có thể giải thích được sự thay đổi từ giai đoạn tăng theo hàm mũ sang giai đoạn tăng tuyến tính, nhưng không giải thích được sự thay đổi từ giai đoạn tuyến tính sang giai đoạn bão hòa.
- Phần trích dẫn bài báo của Peter Kainz của anh Hiếu chỉ ra: ADN nói chung ức chế hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR. Như vậy, sản phẩm PCR không chỉ là cơ chất của enzym DNA polymerase ở chu kỳ kế tiếp mà còn là chất ức chế enzym này. Nồng độ ADN tăng đến ngưỡng nhất định thì sẽ ức chế hoàn toàn hoạt động của enzym, nên mặc dù nồng độ cơ chất tăng lên thì vẫn không có sản phẩm tạo thành. Điều này có thể giải thích được sự thay đổi sang giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR.
Bạn nào có thể giúp tôi hiểu rõ hơn tại sao nồng độ cao của ADN nói chung lại ức chế hoạt động của DNA polymerase trong phản ứng PCR.

 

[Ho Huu Tho]

...In addition, as product DNA and the ratio of primer to product decreases, there is a greater for product strands to anneal thus preventing their use as templates. Since the products are longer than the primers the annealing of complementary product strands can begin at higher temperatures than for primer/template annealing therefore product strands can be sequestered from the reaction.

Ở trên có nhấn mạnh đến "các yếu tố khác" nữa rồi mà. Ví dụ đến một nồng độ nhất định thì reannealing của products sẽ chiếm ưu thế so với bắt cặp với mồi và do đó cũng sẽ không có thêm nhiều products nếu tăng thêm chu kỳ.

Trong đoạn trích dẫn ở trên, tôi đồng ý với tác giả là khi sản phẩm PCR tăng lên thì số phân tử các sợi đơn của sản phẩm PCR tự gắn lại với nhau sẽ tăng lên. Tuy nhiên, từ kết luận này không thể đương nhiên suy ra: số phân tử sản phẩm PCR được gắn mồi sẽ giảm đi. Điều này có nghĩa là không kết luận được tốc độ phản ứng giảm, hay không giải thích được giai đoạn bão hòa của phản ứng PCR.