PCR nhân đoạn gen giàu GC?

[Ho Huu Tho]

Hiện mình phải nhân đoạn gen giàu GC mà nhân mãi không lên. Bạn nào có kinh nghiệm về vấn đề này cho mình vài lời khuyên nhé.
Lần trước cũng có đọc topic nào đó liên quan đến cái này ở diễn đàn mình rồi nhưng tìm lại mãi mà chưa được. Bạn nào biết nó ở đâu chỉ giúp mình với nhé.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

http://biowww.net/detail-195.html

 

[Dương Văn Cường]

Thử nested PCR bác

 

[Hà Thị Minh Thi]

Hiện mình phải nhân đoạn gen giàu GC mà nhân mãi không lên. Bạn nào có kinh nghiệm về vấn đề này cho mình vài lời khuyên nhé.
Lần trước cũng có đọc topic nào đó liên quan đến cái này ở diễn đàn mình rồi nhưng tìm lại mãi mà chưa được. Bạn nào biết nó ở đâu chỉ giúp mình với nhé.

Bạn thêm DMSO và betaine. Mình đã nhân đoạn gene FMR1 với số lần lặp lại của CGG lên đến cả 100 lần, thành phần phản ứng với tổng thể tích 25 ul như sau:
- Gotaq GreenMaster Mix (Promega): 12,5 ul
- DMSO: 2 ul
- betaine (5M, sigma): 6,5 ul
- Còn lại là mồi, DNA và nước cất như tỷ lệ thông thường.
Chúc bạn thí nghiệm thành công!

 

[Ho Huu Tho]

Bạn thêm DMSO và betaine. Mình đã nhân đoạn gene FMR1 với số lần lặp lại của CGG lên đến cả 100 lần, thành phần phản ứng với tổng thể tích 25 ul như sau:
- Gotaq GreenMaster Mix (Promega): 12,5 ul
- DMSO: 2 ul
- betaine (5M, sigma): 6,5 ul
- Còn lại là mồi, DNA và nước cất như tỷ lệ thông thường.
Chúc bạn thí nghiệm thành công!

Cảm ơn bạn nhiều. Bạn Thi có thể cho biết thêm là bạn đã thử với đoạn gen FMR1 có số lần lặp lớn hơn 100 (ví dụ 200 hoặc hơn) chưa? Bạn có thể cho mình trình tự mồi và chu trình nhiệt mà bạn đã sử dụng được không. Nếu bạn đã viết báo về vấn đề này thì cho mình xin bài báo của bạn để tham khảo với nhé.

 

[Ho Huu Tho]

Mình thử chạy PCR với betain và DMSO với nhiều chu trình nhiệt khác nhau, nhưng khi điện di vẫn chẳng thu được band nào.
Tuy nhiên, ở một số điều kiện chu trình nhiệt nhất định thì có tín hiệu rất đậm ở ngay tại giếng điện di (hai giếng cuối trong hình đính kèm), nhưng điện di mãi nó cũng không hề nhúc nhích. Mình đã thử pha loãng hay tinh sạch bằng cồn để điện di lại những cũng không thay đổi được gì.
Mình không biết tín hiệu đậm ở giếng điện di là cái gì và tại sao lại có nó. Bạn nào biết thì giải thích giúp mình với.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Thọ thử tinh sạch sản phẩm qua cột rồi điện di lại. Băng cục gạch như thế chắc là sản phẩm PCR rồi.

Có thể thử với chu trình nhiệt 2 bước:
+98oC 30s
+68oC 2min

 

[Ho Huu Tho]

Bạn thêm DMSO và betaine. Mình đã nhân đoạn gene FMR1 với số lần lặp lại của CGG lên đến cả 100 lần, thành phần phản ứng với tổng thể tích 25 ul như sau:
- Gotaq GreenMaster Mix (Promega): 12,5 ul
- DMSO: 2 ul
- betaine (5M, sigma): 6,5 ul
- Còn lại là mồi, DNA và nước cất như tỷ lệ thông thường.
Chúc bạn thí nghiệm thành công!

@ Hà Thị Minh Thi: Bạn còn lưu cái chu trình nhiệt của phản ứng PCR này thì cho mình xin với nhé. Mình đang phải loay hoay với cái này mãi mà chưa được.

 

[Ho Huu Tho]

Sư phụ đi đâu mà vắng nhà lâu vậy nhỉ?

 

[newbie]

Hiện mình phải nhân đoạn gen giàu GC mà nhân mãi không lên. Bạn nào có kinh nghiệm về vấn đề này cho mình vài lời khuyên nhé.
Lần trước cũng có đọc topic nào đó liên quan đến cái này ở diễn đàn mình rồi nhưng tìm lại mãi mà chưa được. Bạn nào biết nó ở đâu chỉ giúp mình với nhé.

Với PCR đoạn dài và giàu GC bạn có thể dùng kit PCR Long template system (nó có DMSO, và mix enzym) chu trình của mình cho DNA vòng kích thước 1.3Kb: 94C 30s;50C 30s