Biểu hiện ở E.coli

[Nguyễn Ngọc Lương]

Mình có vấn đề thế này:
Sau khi biến nạp vector đã confirm expression cassette vào chủng BL21 RIPL mình chọn ra được vài colony để screen. Sau khi seed 5ml overnight mình cấy vào 5ml mới với 1/100 thể tích 1st seed. Theo manual của hãng thì đợi OD khoảng 0.4-0.5 thì induction. Khốn nạn nỗi là không hiểu tại sao mỗi colony grow theo một tốc độ khác nhau hoàn toàn, chênh nhau tới vài tiếng đồng hồ (có khi lên tới 5 tiếng).
Không biết như thế có bình thường không?
Hôm trước screening bằng SDS-PAGE thì không thấy product vì load ít mẫu quá. Nhưng cũng vì có lỗi trong quá trình induction nên cũng không rõ là nguyên nhân gì.
Cám ơn trước!

 

[Nchicken]

Mình có vấn đề thế này:
Sau khi biến nạp vector đã confirm expression cassette vào chủng BL21 RIPL mình chọn ra được vài colony để screen. Sau khi seed 5ml overnight mình cấy vào 5ml mới với 1/100 thể tích 1st seed. Theo manual của hãng thì đợi OD khoảng 0.4-0.5 thì induction. Khốn nạn nỗi là không hiểu tại sao mỗi colony grow theo một tốc độ khác nhau hoàn toàn, chênh nhau tới vài tiếng đồng hồ (có khi lên tới 5 tiếng).

Giống em, em đã bị thế ạ. Nhưng mà mentor của em cứ bảo mày không phải lo, mày cứ nuôi tiếp đi,khi nào OD 0,4 - 0,5 thì làm Bình thường em chỉ nuôi khoảng 4 tiếng là đạt OD như thế rùi, nhưng có lầm em chơi luôn cho 8 tiếng mới bổ sung IPTG Em nghĩ là vì lúc anh pick từ thạch ra nuôi thì con này to bé khác con kia mà nào đâu lần nào anh cũng cho được lượng kháng sinh y hệt nhau. Theo em thì chẳng sao cả Vì lần nào làm xong em điện di SDS-PAGE cũng chẳng khác gì nhau hoặc do là trình sinh viên còi nên chưa thấy được sự khác nhau ạ.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bị một vố hôm trước, đo OD lần 1 thấy 0.05. Để đấy 1 tiếng rưỡi sau đo lại lên vọt 0.6. Thế nên lần này ngồi đo OD đều đều 15-30 phút một lần. Nhưng có nhiều mẫu chẳng hiểu sao mất tới 5 tiếng mới đạt OD yêu cầu. Phải 'nghiến răng' mua gà quay về ăn để ngồi canh.
Thật ra thì OD từ 1 trở xuống là OK, nhưng muốn biết xem liệu có problems gì không vì thường làm tế bào khả biến thì tb mọc rất ổn định chứ không như thằng BL21 này.
Lượng kháng sinh thì không lo lắm vì lúc nào cũng cho kháng sinh vào LB trước khi chia đều ra các ống nghiệm.
Không có chuyện chọn colony không đều tay bởi 1st seed là nhằm mục đích tránh chuyện mình pick nhiều pick ít ở mỗi colony rồi.
Dù sao bạn có gặp qua rồi thì tôi yên tâm

 

[Nchicken]

Hix, giờ mới đọc kỹ hơn nữa. Sau 1 đêm, bác chỉ chuyển giống từ 5ml sang 5ml mới (1/100 thể tích) ạ. Nhà bác thật là tiết kiệm, cùng đi làm culi như nhau nhưng mà em chuyển từ 5ml sang tận 400ml bác ạ . mà em cho cả 5ml môi trường kia luôn.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mình có vấn đề thế này:
Sau khi biến nạp vector đã confirm expression cassette vào chủng BL21 RIPL mình chọn ra được vài colony để screen. Sau khi seed 5ml overnight mình cấy vào 5ml mới với 1/100 thể tích 1st seed. Theo manual của hãng thì đợi OD khoảng 0.4-0.5 thì induction. Khốn nạn nỗi là không hiểu tại sao mỗi colony grow theo một tốc độ khác nhau hoàn toàn, chênh nhau tới vài tiếng đồng hồ (có khi lên tới 5 tiếng).
Không biết như thế có bình thường không?
Hôm trước screening bằng SDS-PAGE thì không thấy product vì load ít mẫu quá. Nhưng cũng vì có lỗi trong quá trình induction nên cũng không rõ là nguyên nhân gì.
Cám ơn trước!

Lâu em không làm E. coli expression. Có phải là do cái 1st seed của bác mật độ tế bào không như nhau, pha phát triển cũng không đồng nhất (có thể cùng 1 phase nhưng 1 culture ở đầu, culture ở cuối phase) không ạ? Vì thế khi bác cấy theo thể tích 1/100 thì lượng vi sinh vật đầu vào của các mẫu cũng như phase phát triển khác nhau nên nó thế là đúng rồi ạ. Lần sau bác thử đo OD của mỗi cái 1st seed rồi cấy theo cùng 1 OD xem có khác nhau nhiều không ạ? Còn một vấn đề nữa là giống như khi bác cấy trải trên đĩa thạch sau biến nạp, nếu để lâu quá sẽ thấy khuẩn lạc vệ tinh không mang plasmid. Suy ra khi 1st seed của bác mật độ khác nhau thì có mẫu kháng sinh bị sử dụng nhiều, có mẫu ít, có mẫu hết nên có thể dẫn tới khi cấy chuyển lag phase khác nhau và kết quả là bác bị như trên.

Chú ý: Tất cả những điều nói trên là suy luận lý thuyết, chưa qua thực tế

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

@bạn Nchicken: đang screen thôi nên không cần làm tới 400 ml. Screen 2 construct mỗi cái độ 6-8 colonies mà chỉ cần độ 1 ml là kiểm tra được rồi thì làm gì tới 400 ml cho phí.
Hỏi thằng cu trong lab: hóa ra là chuyện nhỏ. Chắc nếu cẩn thận thì phải làm như chú Hưng vậy.
Kể cũng lạ. Tưởng 1st seed thì thằng nào thằng nấy lên 'cao nguyên' cả rồi chứ nhỉ?

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Bởi vì nó trên cao nguyên hết cả nên rất đa dạng chứ ko đồng nhất như những thằng ở dưới dốc. Bác hòa loãng ít thôi (vd: 1/50 => OD ~0.01) thì nó sẽ mọc nhanh vào đều hơn (vì đầu vào lớn, bắt vào dốc sớm).

2. Bọn E.coli ko thằng nào vượt ngưỡng 20 min đẻ 1 lần cả (trừ chủng tự nhiên). Bác ko fai ngồi đo liên tục mà chỉ cần cầm cái ống lên nhìn độ đục bằng mắt là áng được vào 0.4 hay chưa rồi. Bác lôi nó ra chọc ngoái liên tục 1) vừa làm phiền nó (nhất là mùa đông), 2) dễ thằng khác nhảy vô (bọn sinh bào tử) và 3) quan trọng nhất, mệt bác.

3. Đối với bọn mọc cần tới 5h là hơi "lạ". Bác thu mẫu induced và noninduced và xem, nhiều khả năng nó bị leakage của constructs rồi.

4. Bác bỏ Ab vào LB rồi chia ra ống không thể đều bằng bác bỏ Ab vô ống rồi chia LB vào.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đúng là quên cái vụ doubling time. Cứ đi tìm bằng key word là growth curve thì không thấy.
Riêng 15-30 phút thì là những thằng tiệm cận thôi chứ không phải đo từ đầu đến khi đạt OD bằng thôi.
Chưa kiểm tra xem những thằng mọc chậm là do cái gì. Phải xem gel ngày mai mới biết được.
Tưởng seeding thì sau một thời gian tất cả các mẫu đều đạt ngưỡng cả chứ nhỉ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hình như là có hiện tượng leakage. Thấy thằng cu trong lab bảo nhiều khi nó phải xài Amp+ lên tới 100 ug/ml để stabilize plasmid.
Dù sao thì cũng đã chọn được vài chú biểu hiện tốt. Mọc nhanh hay chậm chẳng liên quan gì đến leakage. Có lẽ là chưa...đều tay
Ở VN đã xài pCold chưa nhỉ? Bọn Takara mua bản quyền cái này (bài đăng trên Nature biotech 2004-thương mại hóa 2005) và quảng cáo là dùng biểu hiện rất tốt cho các enzyme (high percentage of soluble recombinant protein). Ở lab mình mỗi lần làm kinase assay đều dùng pCold series. Có lẽ do induction ở nhiệt độ thấp làm nó thích hợp cho biểu hiện enzyme.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Các bạn ở đây gặp trường hợp mà hình PAGE gel (và cả Western) nó ước đoán protein của mình kích thước cao hơn computed MW dự đoán dựa trên trình tự a.a tầm 2kDal chưa nhỉ?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Các bạn ở đây gặp trường hợp mà hình PAGE gel (và cả Western) nó ước đoán protein của mình kích thước cao hơn computed MW dự đoán dựa trên trình tự a.a tầm 2kDal chưa nhỉ?

Chuyện này là bình thường mà, thường do posttranslation modification.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hic, ở E.coli kia. Mà với lại ở yeast hầu hết construct đã làm kích thước đều trùng với computed MW, chỉ riêng một thằng lại thấp hơn khoảng 2kb. Trường hợp ở E.coli thì lại cao hơn khoảng 2kb (chạy cùng 1 gel với 1 thằng có chiều dài a.a giống nhau).
Khổ cái là Histag nằm ở đầu N nên không biết có chuyện truncate hoặc stop codon slip không, bởi 1 thằng thì xài TAG (đúng kích thước) còn thằng kia TGA (sai kích thước).
Cái stop codon của vector là TAG, nhưng cũng chả thấy ai nói là TGA thì bị lỗi gì.

 

[Cao Xuân Hiếu]

AntiHis cho kết quả ntn?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Btw, cái thằng tăng KS => ổn định plasmid chẳng liên quan đến leakage của construct cả. Plasmid có bao nhiêu copy? Inducer là gì?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Chắc sẽ 'bí mật' đặt mồi thử thay stop codon xem sao.
Inducers là heatshock (15C) + IPTG. IPTG thử bừa 0.2mM cái được luôn khỏi cần optimize.
Copy No chắc chắn là cao. Miniprep transformant được tận thế này mà (2 cái lane bên phải, at 3kpb)

Sắp tới lại làm hơn chục constructs như thế này để làm kháng thể cho 2D. Chắc phải nghiên cứu cái DNA vaccination như thế nào chứ thủ công kiểu này mất thời gian mà chả được xơ múi gì.
Đc Hiếu bảo leakage thì nghĩ là leakage chứ đã biết leakage có nghĩa là thế nào đâu

 

[Cao Xuân Hiếu]

Leakage nghĩa là cell vẫn sản xuất recombinant protein trong điều kiện vắng mặt inducer.

Cái protein ladder có phải chỉ ra protein biểu hiện dưới 10kDa ah? Nếu đúng thì sự khác biệt ko có đến 2kDa. Anh miêu tả thêm nguồn gốc và tính chất của antibody đi? Chắc k fai là antiHis chứ? Có thể nhét thêm mẫu uninduced vào thì tốt.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Đã kiểm chứng induced và non-induced ở screening và OD optimization rồi nên không kèm uninduced vào Western nữa.
Cái ladder này là pre-stained ladder của Invitrogen, cái 10kDal là cái màu xanh lá cây mờ mờ nằm phía dưới hết. Cái băng thấp nhất của ladder bên màng là 17kDal. Dùng mouse mAb Anti-His6 đấy, chẳng qua stop development sớm nên nó không đậm thôi chứ để tầm thêm 1 phút nữa thì băng Western sẽ to đùng.
Có một số bài báo nêu rằng SDS-PAGE overestimate MW của 1 số protein. Nhưng trường hợp đã gặp thì vừa overestimate ở E.coli (nếu đúng không có vấn đề gì trong biểu hiện), và lại có một trường hợp underestimate MW đã từng gặp ở Nấm men (cái này thì sure đúng là protein của mình vì check size của Northern thì thấy phù hợp và Western lên băng đậm)

 

[Cao Xuân Hiếu]

2 cái giếng ngoài cùng bên phải là từ cell extract của nấm men? Sao overall pattern trên SDS-PAGE khá giống với các giếng còn lại (từ E.coli)?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

2 cái giếng ngoài cùng bên phải là từ cell extract của nấm men? Sao overall pattern trên SDS-PAGE khá giống với các giếng còn lại (từ E.coli)?

Đâu, đc Hiếu đọc nhầm đấy chứ. Cái đó là nói đến kinh nghiệm biểu hiện từ trước đến giờ. 2 cái giếng bên phải là của 1 construct có stop codon TAG, 4 cái giếng bên trái là của 1 construct có cùng số a.a nhưng stop codon là TGA.
Ví dụ nhiều người nói ở Saccharomyces s. có hiện tượng overglycosylation nhưng thực tế mấy cái antigen mình biểu hiện ở nấm men đều có kích thước đúng với computed MW (không tính glycosylation). Chỉ có 1 trường hợp duy nhất thì kích thước có vẻ thấp hơn khoảng 1-2kDal (thay vì cao hơn nếu thực sự glycosylation)

Cái trường hợp mọc chậm cũng rất lạ. Hôm qua inoculate 2 thằng constructs để seed overnight, thì 1 thằng đã đục ngầu sau 14 tiếng còn thằng kia vẫn trong veo. Bực quá inoculate lại thằng kia thì sau 3 tiếng đã đục ngầu.
Trường hợp leakage do plasmid thì chắc là không có vì induced với non-induced thấy khác rõ. Với lại cái grow pattern cũng không consistent trong cùng 1 colony. Hôm nay thế kia mai thế khác. Có lẽ do thằng BL21 này xài nhiều loại kháng sinh quá chắc.

 

[Dương Văn Cường]

Cái trường hợp mọc chậm cũng rất lạ. Hôm qua inoculate 2 thằng constructs để seed overnight, thì 1 thằng đã đục ngầu sau 14 tiếng còn thằng kia vẫn trong veo. Bực quá inoculate lại thằng kia thì sau 3 tiếng đã đục ngầu.

Dạo này em cũng có vài quả thí nghiệm như ma làm, hết sức thông cảm với bác.

Cố gắng overcome to get desired results thôi bác, ngồi giải thích có mà hết ngày.