Xác định trình tự DNA

[Đinh Văn Khương]

mình có một số vấn đề về sinh học phân tử mà chưa rõ lắm, các bạn có thể giải thích một chút được không.
Việc xác định trình tự các nucleotide của DNA, hiện nay đang sử dụng những phương pháp nào, phương pháp nào được dùng nhiều nhất và vấn đề này ở Việt Nam?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Vào giữa thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự như sau được đưa ra gần như cùng một lúc:
- Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học.
- Phương pháp Sanger (1977) dung enzyme xúc tác sợi bổ sung tương ứng của một chuỗi DNA cần xác định trình tự, nhứng sản phẩm tổng hợp bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.
Hiện này người ta không sử dụng rộng rãi phương pháp hoá học do độc tính của hoá chất. Do đó, chỉ còn phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở VN lẫn thế giới.
Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử được của nó thiếu nhóm 3’-OH. Điều này dẫn đến khi sử dụng ddNTP trong phản ứng tổng hợp PCR, phân tử này vẫn gắn vào gốc được của dNTP trước đó bằng lien kết phosphodiester nhưng do không có gốc 3’-OH nen không thể tạo lien kết mới với bất kỳ phân tử dNTP nào khác do đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt tại đây.
Sanger đã áp dụng đặc tính này bằng cách trong phản ứng tổng hợp DNA, ngoài dNTPs, ông cho thêm vào hỗn hợp một dẫn xuất ddNTP, ví dụ thay dATP bằng ddATP  quá trình tổng hợp dừng lại khi ddATP gắn vào sợi DNA đang kéo dài. Như vậy trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ thu được nhiều phân tử DNA có độ dài khác biệt và tất cả cúng đều chấm dứt tại vị trí A (do việc gắn ddATP thay vì dATP là ngẫu nhiên). Các sản phầm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát trên gel polyacrylamide biến tính. Kết quả trên trường điện di là các vạch có chiều dài khác nhau và đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn.

Phản ứng sau đó được tiến hành lại nhưng thêm ddGTP; cứ như thế tiếp diễn với ddTTP và ddCTP. Chúng ta sẽ thu được 4 trường điện di và suy ra trình tự sợi khuôn DNA.
Trong thực tế, các ddNTP này thường được gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với các màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP. Tiên hành phản ứng tổng hợp với cả 4 dNTPs và 4 ddNTPs, sản phẩm của phản ứng được đưa lên máy đọc. Máy đọc sử dụng tia laser để xác định các chất phát huỳnh quang phát ra từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm và kết quả được chuyển vào máy tính để xử lý và cho ra trình tự cần xác định.

Hiện nay ở VN sử dụng phương pháp đọc trình tự của Sanger với các máy đọc tự động nhập của nước ngoài. Theo tôi biết ở trên viện CNSH có một cái sử dụng liên tục, ở trường ĐHBK, ĐHKHTN, ĐHSP, viện di truyền nông nghiệp… cũng đều có nhưng hầu như chả sử dụng mấy. Cái máy mua về hay được tại trợ theo dự án để đấy cho đẹp thôi, tiền hoá chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự hơi to nên chả dại dung nhiều, nhỡ không ra hoặc hỏng máy thì toi.

Định Post lên đây mấy cái hình và sơ đồ cái máy đọc trình tự ABI 310 coi chơi nhưng chả post được, bác admin nên thêm cái chức năng add hình ảnh vào nhé.

 

[Dương Văn Cường]

Vâng. Xin cảm ơn casper. Tôi sẽ thêm ngay chức năng đính kèm file.

Hiện nay ở VN sử dụng phương pháp đọc trình tự của Sanger với các máy đọc tự động nhập của nước ngoài. Theo tôi biết ở trên viện CNSH có một cái sử dụng liên tục, ở trường ĐHBK, ĐHKHTN, ĐHSP, viện di truyền nông nghiệp… cũng đều có nhưng hầu như chả sử dụng mấy. Cái máy mua về hay được tại trợ theo dự án để đấy cho đẹp thôi, tiền hoá chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự hơi to nên chả dại dung nhiều, nhỡ không ra hoặc hỏng máy thì toi.

Bạn nói đúng. Tôi ở viện CNSH nên tôi biết cái máy giải trình tự đó luôn hoạt động hết công suất. Các bác lãnh đạo viện đang tính mua thêm một cái nữa. Còn các máy ở những nơi khác tôi không rõ nên không có ý kiến.

Bổ xung thêm một chút. Nếu bạn nào có thắc mắc tại sao vừa rồi cúm gà phải đem sang Hồng Kông để giải trình tự thì đó là do vấn đề an toàn phòng thí nghiệm, chứ không phải do chúng ta không giải trình tự được nó. Việc giải trình tự không phải là dễ nhưng cũng không còn là một vấn đề khó trong Sinh học phân tử - vào lúc này và tại Việt Nam.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Tôi đồng ý với bạn. Thật ra với đà phát triển hiện nay thì việc đọc trình tự dần trở thành một công cụ cho SHPT rồi chứ không còn là vấn đề quá khó và "cao siêu" như trước nữa. Vấn đề là sử dụng thế nào và hiệu quả ra sao thôi.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Hiện nay ở VN sử dụngnhập của nước ngoài. Theo tôi biết ở trên viện CNSH có một cái sử dụng liên tục, ở trường ĐHBK, ĐHKHTN, ĐHSP, viện di truyền nông nghiệp… cũng đều có nhưng hầu như chả sử dụng mấy. Cái máy mua về hay được tại trợ theo dự án để đấy cho đẹp thôi, tiền hoá chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự hơi to nên chả dại dung nhiều, nhỡ không ra hoặc hỏng máy thì toi.

Bạn nói đúng. Tôi ở viện CNSH nên tôi biết cái máy giải trình tự đó luôn hoạt động hết công suất. Các bác lãnh đạo viện đang tính mua thêm một cái nữa. Còn các máy ở những nơi khác tôi không rõ nên không có ý kiến.

Khà khà, dontcry nên chuyển sang là dont try so hard đi. Bạn có fải sequencer operator ko nhẩy

Chào mọi người nhé.

 

[Ginno]

To: Casper
Casper hiểu về sequecing khá rõ, thế Casper có hiểu về nguyên tắc và cơ chế của tiến trình Genotyping không? Nếu biết xin bạn chia sẻ cho chút kinh nghiệm với!

Cám ơn trước nhé

 

[Nguyễn Phước Hùng]

chào các bác

Theo em thay thi mây phuong phap cua cac bac pót len deu da cu roi ,va hien nay thi rat it nguoi lam,cac bac co thong tin gí nhieu ve cac phuong phap khac khong tat nhien la ngoai tru phuong phap su dung SNP hay microarray ?

 

[Nguyễn Hồng Khanh]

ABI 310 là Model, bạn vui lòng cho mình biết nhà sản xuất.
Chân thành cảm ơn!
khanhtssc@yahoo.com

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

ABI 310 là Model, bạn vui lòng cho mình biết nhà sản xuất.

Cái này của Applied Biosystems, bạn xem thông tin ở đây http://www.appliedbiosystems.com/ca...p?hierarchyID=101&category3rd=111903&trail=no

 

[hoangphuong]

ah cho mình hỏi có phải hiện nay phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen ở viện công nghệ do ts Nông văn Hải pphụ trách phải không
các công trình của viện có thể tham khảo ở đâu vậy ? :?:
tiện thể hỏi các bác nói rỏ một chút về công nghệ phân tich gen tự động PCR được không :?:

 

[Cao Xuân Hiếu]

ah cho mình hỏi có phải hiện nay phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen ở viện công nghệ do ts Nông văn Hải pphụ trách phải không

TS Nông Văn Hải là trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện CNSH. Phòng TNTĐ về CN gen được quản lý bởi một hội đồng đủ cả thành viên ở các Viện, trường khác nhau. Theo tôi biết thì giám đốc phòng TNTĐ này là TS. Lê Trần Bình, đồng thời là Viện trưởng Viện CNSH.

các công trình của viện có thể tham khảo ở đâu vậy ? :?:

Website của Viện http://www.ibt.ac.vn

tiện thể hỏi các bác nói rỏ một chút về công nghệ phân tich gen tự động PCR được không :?:

chẳng hiểu gì cả, bạn viết thuật ngữ một cách chính xác hơn hoặc bệ nguyên gốc tiếng Anh lên nhé.

 

[Phan Minh Tuấn]

ah cho mình hỏi có phải hiện nay phòng thí nghiệm trọng điểm về công nghệ gen ở viện công nghệ do ts Nông văn Hải pphụ trách phải không

TS Nông Văn Hải là trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng thuộc Viện CNSH. Phòng TNTĐ về CN gen được quản lý bởi một hội đồng đủ cả thành viên ở các Viện, trường khác nhau. Theo tôi biết thì giám đốc phòng TNTĐ này là TS. Lê Trần Bình, đồng thời là Viện trưởng Viện CNSH.

Đính chính là ?8O ?TS Nông Văn Hải ngoài vị trí là trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng, hiện đang đương nhiệm vị trí Giám đốc Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen

tiện thể hỏi các bác nói rỏ một chút về công nghệ phân tich gen tự động PCR được không

8O vụ này bó tay, chẳng hiểu bác này hỏi gì cả ?:?:

 

[Trương Quốc Phong]

tiện thể hỏi các bác nói rỏ một chút về công nghệ phân tich gen tự động PCR được không

Có phải ý bạn muốn hỏi về phương pháp xác định trình tự nucleotides trực tiếp không?
Đúng như vậy thì tôi sẽ mô tả tóm tắt kỹ thuật đó cho các bạn:
Phương pháp xác định trình tự nucleotide trực tiếp (direct sequencing) là phương pháp xử dụng sản phẩm PCR làm khuôn cho phản ứng Sanger (tôi gọi như vậy, có thể người khác không gọi như vậy nhưng bản chất chỉ là một).
Phương pháp thông thường là sử dụng plasmid tái tổ hợp mang gen quan tâm làm khuôn cho phản ứng Sanger.
Do đó để thực hiện phản ứng này cần:
1. Sản phẩm PCR, đã qua tinh sạch làm khuôn
2. Primers: dùng chính cặp mồi bạn dùng để thực hiện phản ứng PCR ở trên.
3. dNTPs
4. ddNTPs được đánh dấu huỳnh quang.
5. Các thành phần khác để thực hiện được phản ứng PCR.
Notes: Phương pháp này khác phương pháp gián tiếp ở chỗ nào ?
+ Đoạn gen quan tâm (sản phẩm PCR) không cần cloning vào vector thích hợp cho sequencing.
+ Primers: Dùng cặp mồi dùng đã dùng cho PCR,
+ Đánh dấu huỳnh quang: Thông thường đánh dấu vào ddNTPs, cũng có thể đánh dấu vào primer nhưng rất hiếm khi vì nó rất đắt và không thực tiễn.
+ Dùng bộ Kit hoàn toàn khác với bộ Kit dùng cho xác định gián tiếp.

Hiện nay tôi không rõ ở VN đang dùng loại nào để xác định trình tự, nhưng theo kinh nghiệm thực tiễn thì tôi thấy phương pháp này cho hiệu quả xác định trình tự không cao vì một số nguyên nhân. Tại thời điểm 2001, theo tham khảo của tôi thì tại VN chưa có ai dùng phương pháp này, và tôi cũng đã quyết định mua 1 bộ Kit để thử (nó rất đắt), sau khi dùng thử và trao đổi trực tiếp với chuyên gia của hãng Amersham Biosciences thì họ cũng công nhận về hiệu quả của phương pháp này. Nó chỉ nên ứng dụng trong 1 số trường hợp thôi. Tôi nói như vậy để bạn tham khảo trước khi muốn thử với phuơng pháp này.

 

[hamon]

Phương pháp giải trình tự sản phẩm PCR trực tiếp đó, cụ thể sẽ được ứng dụng trong những trường hợp nào hả bác?