Biểu hiện gene của eukaryote trong prokaryote

[Dương Văn Cường]

Theo các bác thì để biểu hiện gene của eukaryote trong host là prokaryote (lấy E. coli làm ví dụ) thì cần lưu ý những điểm gì?

1. Bảng mã di truyền cần được tối ưu vì mỗi sinh vật ưu tiên sử dụng một số mã di truyền nhất định.

2. Vị trí sau khi biểu hiện của protein trong eukaryote cells có ảnh hưởng gì khi biểu hiện trong prokaryote cells? Có lý thuyết chung gì không hay chỉ tùy trường hợp cụ thể?

3. Liệu những protein trong ti thể và lục lạp sẽ có ưu thế khi biểu hiện trong prokaryote?

4. Những điều gì khác có tính chất thành bại cần lưu ý?

Thanks for any comment

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Hình như nhớ không nhầm thì codon optimization là thứ sau cùng cần phải làm ở E.coli vì host này gần như không hiếm tRNA nào.

 

[Dương Văn Cường]

Mới mò ra cái này

http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Các bạn có thể mua phần mềm leto của công ty Entelechon để tối ưu synthetic gene. Phần mềm này có thêm vài đặc điểm như giúp bạn loại đi những mRNA destablizing elements GC content...v.v (có thể xài thử demo trong 3 tháng, tất cả chức năng đều đầy đủ ngoại trừ print kết quả) Ngoài ra có phần mềm này free:
[FONT=&quot]http://www.entelechon.com/2008/10/backtranslation-tool/[/FONT]
Trong này cho phép bạn chọn codon usage từ nhiều loài để back translate

 

[Concobebek51]

Bieu hien protein

Em chào anh!
Anh ơi,em có 1 thắc mắc về biểu hiện protein. Anh xem rùi giải đáp giúp em với.
Trên hình ảnh điện di em gửi kèm. Có 4 giếng.
Giếng 1, 2 là hình ảnh điện di protein của vi khuẩn chưa mang vector tái tổ hợp
Giếng 3,4 là ảnh điện di protein của chủng vi khuẩn đã mang vector tái tổ hợp.
Các band ở vị trí ngang với mũi tên màu đỏ là band mong đợi. Ở chủng đã mang gen thì thu được protein với mức độ biểu hiện tốt nhất thì đúng rồi. Nhưng ở giếng 1, vị trí đánh dấu các mũi tên màu xanh, em ko rõ tại sao mức độ biểu hiện protein cũng khá đậm, mà đó ko phải là protein mình mong đợi.
Mong anh trả lời giúp em. Em cảm ơn

 

[Cao Xuân Hiếu]

giếng 1 khác gì với giếng 2; giếng 3 khác gì giếng 4?

bạn phải đưa vào tất cả các giếng 1 lượng protein tương đối bằng nhau thì băng to hay băng đậm mới có ý nghĩa

 

[Concobebek51]

giếng 1 khác gì với giếng 2; giếng 3 khác gì giếng 4?

bạn phải đưa vào tất cả các giếng 1 lượng protein tương đối bằng nhau thì băng to hay băng đậm mới có ý nghĩa

Mình load mẫu ở tất cả các giếng với thể tích như nhau. Để mình gửi lại ảnh khác có kèm chú thik rõ hơn

 

[Cao Xuân Hiếu]

cùng thể tích nhưng khác nồng độ thì lượng protein đầu vào tất nhiên là ko bằng nhau. Cách làm tốt hơn là đo OD rồi hòa cell pellet với Sol Mix 2x với tỷ lệ 0.01 OD unit /μl. Điện di 0.05 OD unit để kiểm tra. Xem thêm link dưới

Chương 20b: Tách protein tái tổ hợp từ thể vùi của E. coli trong điều kiện biến tính

Về cái giếng 1. Nếu chú ý về band pattern thì sẽ thấy mẫu ở giếng 2,3,4 có pattern tương đối giống nhau và khác rất nhiều với giếng 1. Tế bào trong giếng 1,2 có mang plasmid giống với giếng 3,4 (nhưng ko mang insert) hay là chỉ là tế bào khả biến ko plasmid?

 

[Concobebek51]

Về cái giếng 1. Nếu chú ý về band pattern thì sẽ thấy mẫu ở giếng 2,3,4 có pattern tương đối giống nhau và khác rất nhiều với giếng 1. Tế bào trong giếng 1,2 có mang plasmid giống với giếng 3,4 (nhưng ko mang insert) hay là chỉ là tế bào khả biến ko plasmid?[/QUOTE]

Tế bào trong giếng 1,2 có mang plasmid giống 3,4 nhưng ko mang insert.
Cho mình hỏi thêm câu nữa. mình đang làm về vấn đề tái tổ hợp. Đầu tiên phải biến nạp plasmid chưa mang gen vào tế bào khả biến e.coli. nếu mình biến nạp ngay vào chủng biểu hiện để tạo số bản copy lớn thì có ảnh hưởng gì ko ?chủng biểu hiện là BL21(DE3)

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tế bào trong giếng 1,2 có mang plasmid giống 3,4 nhưng ko mang insert.
Cho mình hỏi thêm câu nữa. mình đang làm về vấn đề tái tổ hợp. Đầu tiên phải biến nạp plasmid chưa mang gen vào tế bào khả biến e.coli. nếu mình biến nạp ngay vào chủng biểu hiện để tạo số bản copy lớn thì có ảnh hưởng gì ko ?chủng biểu hiện là BL21(DE3)

như vậy, có nhiều khả năng IPTG đã cảm ứng gây biểu hiện 1 đoạn sản phẩm nhất định trên plasmid. Sản phẩm này gây 1 dạng stress nhất định đối với tế bào, và 2 vạch protein kia là những protein mà tế bào vi khuẩn sinh ra như là 1 phản ứng đối phó với stress như vậy.

chủng E.coli tách dòng (DH5a, TOP10F) có khả năng maintain plasmid tốt hơn, thích hợp để nuôi lên và tách plasmid ra để phân tích. Trong khi đó BL21(DE3) là chủng đột biến thích hợp cho mục đích biểu hiện protein ngoại sinh.

 

[Concobebek51]

như vậy, có nhiều khả năng IPTG đã cảm ứng gây biểu hiện 1 đoạn sản phẩm nhất định trên plasmid. Sản phẩm này gây 1 dạng stress nhất định đối với tế bào, và 2 vạch protein kia là những protein mà tế bào vi khuẩn sinh ra như là 1 phản ứng đối phó với stress như vậy.

chủng E.coli tách dòng (DH5a, TOP10F) có khả năng maintain plasmid tốt hơn, thích hợp để nuôi lên và tách plasmid ra để phân tích. Trong khi đó BL21(DE3) là chủng đột biến thích hợp cho mục đích biểu hiện protein ngoại sinh.

Nếu mà do IPTG cảm ứng gây biểu hiện 1 đoạn sản phẩm trên plasmid thì ở dịch protein có mang gen nó cũng phải có sự biểu hiện tương ứng chứ nhỉ. khó hiểu quá. các thày cô cứ bắt bẻ cái ảnh này.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Nếu mà do IPTG cảm ứng gây biểu hiện 1 đoạn sản phẩm trên plasmid thì ở dịch protein có mang gen nó cũng phải có sự biểu hiện tương ứng chứ nhỉ. khó hiểu quá. các thày cô cứ bắt bẻ cái ảnh này.

Hỏi thử thầy cô xem họ trả lời như thế nào? :-D Rồi so sảnh với những dòng dưới đây.

Vấn đề ở đây là cái empty plasmid đấy. Nó sẽ biểu hiện 1 đoạn nhất định ở vùng MCS tùy vào construct như thế nào. Tuy nhiên có thể tượng tưởng là đoạn đó khá là nhỏ thôi. Bởi vì nó khá nhỏ nên đồ rằng vi khuẩn ko khống chế được cường độ biểu hiện và tạo ra 1 lượng khá lớn đoạn tưởng như vô hại đấy. Và lượng lớn đoạn ngắn này đã gây đáp ứng cho tế bào vi khuẩn.

Trong trường hợp plasmid có insert. Kích thước insert là tương đối nên khi biểu hiện lượng lớn, tế bào vi khuẩn phản ứng theo 1 chiều hướng khác, ví dụ tìm cách targetting protein này vào inclusion bodies. Vì là 2 cơ chế đáp ứng sinh lý khác nhau, nên protein profiling là khác nhau.

Trên đây chỉ là giả thuyết thôi nhé. Anh chưa đọc tài liệu tham khảo và nghe ai nói về vấn đề này. Tuy nhiên giải quyết việc này khá dễ, chạy 2D gel và làm MS/MS là có câu trả lời cực kỳ clear ngay.

Chúc vui vẻ,

 

[Concobebek51]

èo, làm cái protein này bựa thật đấy. khó như con ma.
Cảm ơn anh nhiều ạ.

Trên đây chỉ là giả thuyết thôi nhé. Anh chưa đọc tài liệu tham khảo và nghe ai nói về vấn đề này. Tuy nhiên giải quyết việc này khá dễ, chạy 2D gel và làm MS/MS là có câu trả lời cực kỳ clear ngay.

Chúc vui vẻ,[/QUOTE]

 

[Nchicken]

Em này chắc học BKHN và đang chuẩn bị bảo vệ SV NCKH (hóng được là thứ 6 tuần này thì phải). Ném đá hội nghị tí và chúc bạn may mắn.
Ý anh Hiếu nói là đoạn nhỏ mà nó biểu hiện được thành một protein có trọng lượng phân tử lớn hơn cái đoạn insert có ý nghĩa kia ạ?
Bạn nên tìm hiểu là tại sao mà có cái đoạn insert thì lại ức chế biểu hiện 2 protein kia kìa? Nó ức chế sự biểu hiện của 2 protein này hay là nó sinh ra cái j nữa mà làm 2 protein này biến mất (xin phép cho mình gợi hình chứ ko dùng ngôn ngữ chuyên ngành)
Và quan trọng, khi so sánh thì sẽ so sánh cùng một lượng protein chứ ko so sánh thể tích.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

@Conconbebek51: Không hiểu ai hướng dẫn bạn mà lại bố trí 1 thí nghiệm như thế này? Nếu dùng hình ảnh này cho vào báo cáo gì đấy thì đáng được 0 điểm.

1. Tại sao không có mẫu trước cảm ứng?

2. Tại sao không xác định nồng độ protein rồi dùng cùng lượng protein cho mỗi mẫu để điện di? Khi lượng protein ở các giếng khác nhau như vậy thì tốt nhất vứt đi làm lại, tốn công suy nghĩ làm gì cho mệt.

Nhưng thôi, vì có vẻ là dân BK nên có mấy điều thế này:
1. Tại sao lại chỉ quan tâm những band đậm hơn lên mà không để ý có những band bị mờ đi hoặc thậm chí biến mất? Đời là thế, có cái được thì cũng phải có cái mất và ngược lại nhỉ.

2. Bạn biểu hiện dùng vector thì trong vector có những gì nhi? Ví dụ chắc phải có gene kháng kháng sinh. Mà gene này không biết có biểu hiện thành protein không nhỉ?

3. Bạn có lặp lại thí nghiệm chưa? Khi lặp lại có gặp cùng hiện tượng không?

Nên nhớ hai trong những nguyên tắc bất di bất dịch để đưa ra 1 kết luận từ kết quả thí nghiệm là: Có control đúng và kết quả lặp lại!

 

[Nchicken]

Hehe, ý kiến của mình trùng khít với ý kiến bác Hưng. Like quá, ít ra mình cũng thấy mình không ngu lắm.
Tự nhiên suy nghĩ một điều :"Nếu tất cả thí nghiệm SH đều ra kết quả perfect từ lần đầu tiên thì sau bao lâu sẽ có 1 tiến sỹ ra lò?"

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nhớ là nuôi cùng đk nữa , tức tất tần tận PC, NC và mẫu cùng làm trong 1 đk.

Mình nuôi nấm men (lên men bánh mì) ở 20 và 30 độ, protein pattern khác hẳn nhau. Thậm chí cùng 1 lượng tế bào, lượng protein tách ra ở 20 độ cũng khác 30 độ.

Về biểu hiện ở E.coli mình còn thấy hiện tượng tăng kích thước protein biểu hiện, không hiểu là lý do gì. Ví dụ kích thước tính toán 13 thì có thể nhảy lên tận 17. Mình chứng kiến 2 trường hợp như thế.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nhưng thôi, vì có vẻ là dân BK nên có mấy điều thế này:

Câu này thật là lưỡng nghĩa:
+ Nhưng thôi dù sao cũng là đồng môn nên anh tha cho lần này
+ Nhưng châm chước dân BK là dân kỹ thuật, không biết bố trí thí nghiệm thế nào nên anh chỉ cho mà biết