Ho Huu Tho
Senior Member
Cho mình hỏi là sau phản ứng PCR có tối đa khoảng bao nhiêu copy của sản phẩm được tạo thành (ví dụ trong thể tích phản ứng là 25 microL)?
Số copy sau phản ứng PCR là bao nhiêu?
- Thread starter Ho Huu Tho
- Start date
voh5
Senior Member
Tối đa ấy à? Dễ không ấy mà
, bác thử làm theo phương pháp sau với các bước:
1) Bác đếm số lượng khuôn ADN của bác đưa vào nhé! Ý là có bao nhiêu đoạn ADN làm bắt cặp được với primers của bác để tạo ra sản phẩm PCR thì bác dếm hết cho em! Cộng lại con số này được tổng là A nhé!
2) Công thức tính toán số lượng bản copy tối đa B = A x 2^n (hai mũ n), với n là số chu kỳ tổng hợp (số lần lặp ấy bác).
Đây là phương pháp của em! Quan trọng là bác có đếm được A hay không thôi
!!! Trong trường hợp bác có thể đếm được A thì không cần dùng công thức làm gì, cứ tiến hành làm luôn với B cho nhanh!
Đùa thôi, chứ đợt này nhiều câu hỏi đưa lên Sinh học Việt nam với độ khó cao mà độ chuối cũng nặng! Chẳng biết thế nào mà trả lời cả! >>> Hết thuốc !
Còn nghiêm túc mà nói, để biết số lượng (định lượng), thì tham khảo thêm phương pháp tiến hành Realtime PCR bác à.
, bác thử làm theo phương pháp sau với các bước:1) Bác đếm số lượng khuôn ADN của bác đưa vào nhé! Ý là có bao nhiêu đoạn ADN làm bắt cặp được với primers của bác để tạo ra sản phẩm PCR thì bác dếm hết cho em! Cộng lại con số này được tổng là A nhé!
2) Công thức tính toán số lượng bản copy tối đa B = A x 2^n (hai mũ n), với n là số chu kỳ tổng hợp (số lần lặp ấy bác).
Đây là phương pháp của em! Quan trọng là bác có đếm được A hay không thôi
!!! Trong trường hợp bác có thể đếm được A thì không cần dùng công thức làm gì, cứ tiến hành làm luôn với B cho nhanh!Đùa thôi, chứ đợt này nhiều câu hỏi đưa lên Sinh học Việt nam với độ khó cao mà độ chuối cũng nặng! Chẳng biết thế nào mà trả lời cả! >>> Hết thuốc !
Còn nghiêm túc mà nói, để biết số lượng (định lượng), thì tham khảo thêm phương pháp tiến hành Realtime PCR bác à.
Ban Ho Huu Tho:
Cau tra loi se tuy theo rat nhieu yeu to: number of PCR cycles, polymerase, concentration of DNA template, primers, dNTP mix, etc. Tuy nhien, neu Ban muon biet "maximum yield" thi cac ky thuat vien da tung lam viec voi Toi thuong nhan duoc khoang 5-6 microgram/reaction (using genomic DNA or plasmid DNA as template). Thinh thoang, ho nhan duoc 10 microgram/reaction. Ngoai ra, neu Ban khong quan tam nhieu den "quality" cua PCR product thi Toi nghi la Ban con co the nang cao "yield" them nhieu nua.
Sau do, Ban co the do OD260 de tinh nong do cua DNA, roi tu do co the suy ra copy number (dua tren molecular weight cua PCR product).
Chuc Ban thanh cong,
David-
Ho Huu Tho
Senior Member
Tiếc là mình không biết làm tính cộng như bạn hướng dẫn, nhưng cái này tớ tính được bằng cách làm tính chia. Tóm lại, mình tính được số A.Tối đa ấy à? Dễ không ấy mà
1) Bác đếm số lượng khuôn ADN của bác đưa vào nhé! Ý là có bao nhiêu đoạn ADN làm bắt cặp được với primers của bác để tạo ra sản phẩm PCR thì bác dếm hết cho em! Cộng lại con số này được tổng là A nhé!
Cái công thức B= Ax2^n chỉ đúng khi hiệu suất phản ứng PCR là 100% ở tất cả các chu kỳ, mà điều này thì không bao giờ xảy ra cả nên không thể áp dụng được.
Phương pháp Realtime PCR là để tính số copy ban đầu trước khi phản ứng bạn ạ. Cái mình muốn hỏi là số copy thu được sau phản ứng mà. Thế là bạn bán nhầm "thuốc" cho mình rồi nhé.
Ho Huu Tho
Senior Member
Cho mình hỏi là có cần tinh sạch trước khi đo không và nếu cần thì nên dùng phương pháp tinh sạch nào?
Có cần anh ạ. Vài ngày trước em có 3 sản phẩm PCR kích thước khoảng 300bp, chia đôi, 1 phần đem đi tinh sạch và phần còn lại thì không, kết quả đo:
Mẫu 1: Không tinh sạch 418.99 ng/ul
Có tinh sạch: 19.16
Mẫu 2: 519.47
11.85
Mẫu 3: 326.94
8.22
Pha loãng 1/10, lấy mỗi mẫu 4ul điện di trên gel agarose 2%, kết quả là các mẫu tinh sạch cho band sáng rõ, đối chiếu độ sáng với DNA ruler thì giá trị định lượng tương đối khớp. Các mẫu không tinh sạch thì gần như không nhìn thấy gì.
Nếu công việc của anh cần tính số copy (chứ không phải hỏi chơi cho vui) thì thuốc của voh5 kê là đúng rồi. Dùng Realtime PCR và stop reaction ở chu kỳ cuối của log phase thì anh sẽ có con số tương đối chính xác theo lý thuyết.
Neu muc dich chinh cua Ban la muon biet nong do cua PCR product thi Ban phai purify, neu khong thi khi Ban do OD260, spectrophotometer se do ca "free nucleotides" va "DNA template" in your PCR reaction.
David-
voh5
Senior Member
>>> Em dựa vào câu hỏi của bác để trả lời, cái phần em bôi đậm ấy! Nói một cách rất nghiêm túc và logic ấy chứ nhỉ???
>>> Bác dựa vào đâu mà nói là nó khong bao giờ xảy ra cả??? Thật ra, cái công thức tính của em là em nói thế thôi, còn nói một cách khoa học thì đấy là tính toán, vì bác đặt ra câu hỏi là có tối đa khoảng bao nhiêu bản copy được tạo thành, thì câu trả lời của em là CHÍNH XÁC MỘT CÁCH TỐI ĐA RỒI! Có chỗ nào sai đâu?
Thật ra, PCR là định tính, nên chẳng ai hỏi là số bản copy một cách tối đa như bác cả! Ngay cả Realtime PCR, có ai nói chính xác có bao nhiêu bản copy được đâu? Chính xác một cách tương đối! Nên kể cả khi các bác đo OD hay gì gì đi nữa, thì câu trả lời cũng chỉ là tương đối!
Trừ khi, bác làm 01 gen trong 1 tế bào/cơ quan mà bạn biết chính xác được có bao nhiêu bản copy của gen đấy trong đó, thì may ra bạn mới tính được cái số A. Cuối cùng, nói một cách chính xác thì câu trả lời của em là mua vui cuối tuần cho anh em bà con đọc thôi
>>> Cảm ơn ông bạn nhé! Mà đi làm PhD ở đâu thế?
Ho Huu Tho
Senior Member
Cái này dễ thôi mà, bạn thử suy nghĩ xem là tại sao nhé?
Nếu tính như cách của bạn thì mình không cần tính cũng biết số copy tối đa của sản phẩm PCR là bằng số copy của primer. Cách này khỏi phải công thức gì cho rách việc nhỉ!Thật ra, cái công thức tính của em là em nói thế thôi, còn nói một cách khoa học thì đấy là tính toán, vì bác đặt ra câu hỏi là có tối đa khoảng bao nhiêu bản copy được tạo thành, thì câu trả lời của em là CHÍNH XÁC MỘT CÁCH TỐI ĐA RỒI! Có chỗ nào sai đâu?
Hi hi, cái này là ai nói với bạn đấy, PCR thì có thể định tính mà cũng có thể là định lượng, tùy thuộc việc chúng ta thiết kế nó như thế nào thôi bạn ạ. Ví dụ, bằng PCR người ta xác định được trong một tế bào có 2 hay 3 NST số 21, để từ đó chẩn đoán được hội chứng Down. Vậy không biết bạn cho rằng cái này là định tính hay định lượng đây.
Cái này thì không có gì để phản đối, cứ tự nhiênCuối cùng, nói một cách chính xác thì câu trả lời của em là mua vui cuối tuần cho anh em bà con đọc thôi
.
Nguyễn Duy Hưng
Senior Member
bạn có thể làm thế này
- Đặt cặp primer với forward primer gắn biotin và reserve primer gắn enzyme hay protein gì đó mà có thể dùng elisa để định lượng đc.
- Chạy PCR
- Cho mẫu lên well có coated Streptavidin. Làm ELISA, đo cường độ màu. Nếu bạn có protein chuẩn để đối chứng thì sẽ tính đc nồng độ protein có trong mẫu. Suy ra được nồng độ của sản phẩm PCR. Với thể tích mẫu thì bạn sẽ suy ra được hàm lượng sản phẩm sau PCR.
- Đặt cặp primer với forward primer gắn biotin và reserve primer gắn enzyme hay protein gì đó mà có thể dùng elisa để định lượng đc.
- Chạy PCR
- Cho mẫu lên well có coated Streptavidin. Làm ELISA, đo cường độ màu. Nếu bạn có protein chuẩn để đối chứng thì sẽ tính đc nồng độ protein có trong mẫu. Suy ra được nồng độ của sản phẩm PCR. Với thể tích mẫu thì bạn sẽ suy ra được hàm lượng sản phẩm sau PCR.
Ho Huu Tho
Senior Member
Cách này chắc sẽ có độ chính xác cao vì dựa vào tín hiệu huỳnh quang của ELISA, nhưng lại phải thiết kế hơi công phu tốn kém, chắc không phù hợp với trường hợp của mình.
Nếu áp dụng theo cách này, bạn có thể cho biết nên áp dụng những phương pháp tinh sạch nào được không?
nếu tính cho chi li ra thì phải là 2^n-(n+1), trong đó 2^n là tổng số phân tử sau n chu kỳ, trừ đi n là số phân tử copy trực tiếp từ khuôn ban đầu (nên chiều dài không xác định) và 1 là chính khuôn ban đầu.Mình thường chẳng bao giờ đo lượng sp sau PCR. Tuy nhiên mình thấy khi làm Southern hay Northern probe, thay vì dùng digestion từ plasmid thì mình xài PCR products nó nhanh hơn và cho nồng độ cao hơn. Trong sách hướng dẫn nói lượng template nên từ 25ng - 100 ng. Mình xài khoảng 10ul trên 50 ul tổng thể tích phản ứng (30 chu kỳ) thì kết quả rất ổn. Như vậy 10 ul chắc cũng chứa đâu đấy khoảng từ 1 đến 200 ng là cao nhất.
Ho Huu Tho
Senior Member
n là rất nhỏ so với 2^n, nên không ảnh hưởng đến độ chính xác của phép đo và việc tính toán chi li như vậy không làm tăng độ chính xác. Tuy nhiên, không thể tính số copy sản phẩm PCR là 2^n vì hiệu suất phản ứng PCR không thể đạt 100%. Trung bình sau mỗi chu kỳ của PCR, một sợi khuôn sẽ tạo ra x sợi mới (x thay đổi theo các chu kỳ và < 1). Vì thế có công thức lý thuyết để tính số copy sản phẩm PCR là (1+x)^n. Tuy nhiên, x chưa biết lại thay đổi qua các chu kỳ nên không thể áp dụng cái công thức này để tính toán thực tế được vì cho sai số quá lớn.
Ho Huu Tho
Senior Member
Khối lượng phân tử của sản phẩm PCR (100 bp) khoảng 30.000 Dal, tương đương với 30.000/6.023X10^23 (g). Như vậy, nếu ước lượng của bạn đúng thì trong 50 ul sản phẩm PCR sẽ có khoảng từ 10^11 đến 10^13 copy là cao nhất. Con số này có ý nghĩa với thí nghiệm của mình. À, nhưng bạn có thể cho biết thêm là sản phẩm PCR của bạn có khối lượng phân tử là bao nhiêu được không?
Sản phẩm PCR của mình khoảng 400 bp. Có một dạo mình khốn khổ với cái probe vì hình như 400 bp khi làm probe reaction rất dễ bị mất mát khi tinh sạch bằng Qiagen nucleotide removing column. Làm Northern nó cứ lên tín hiệu rất mờ, truy mãi mới tóm cổ được là do thằng probe yếu. Sau khi chơi hẳn 10 ul từ PCR reaction thì chỉ cần expose film 1 ngày là đã đủ tín hiệu.
Chắc chắn lượng DNA sp (ng-ug) phụ thuộc vào chiều dài của sp PCR. Tốt nhất bạn nên tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột (loại enzyme, nucleotide). Nếu bị nonspecific product thì bạn nên dùng gel elution còn không cứ qua cột là đủ sạch để đo phổ rồi.
Chắc chắn lượng DNA sp (ng-ug) phụ thuộc vào chiều dài của sp PCR. Tốt nhất bạn nên tinh sạch sản phẩm PCR bằng cột (loại enzyme, nucleotide). Nếu bị nonspecific product thì bạn nên dùng gel elution còn không cứ qua cột là đủ sạch để đo phổ rồi.
voh5
Senior Member
Uhm, đọc xong type bừa tí nữa, các bác đừng bảo em cùn nhé, với lại topic này không hot lắm, làm tí nữa cho xôm:
Lần đầu tiên nghe nói là biết số-copy-tối-đa-của-sản-phẩm-PCR-là-bằng-số-copy-của-primer. Có thể em học không thấu, đọc chưa đến, nhưng nếu như thế thì hoạc là muốn tính được như bạn nói, thì (1) phải HỎI NHÀ TỔNG HỢP PRIMER về số lượng bản sao oligos được tổng hợp trong primer của bạn, hoạc (2) BẮT NHÀ TỔNG HỢP PHẢI TỔNG HỢP ĐÚNG SỐ LƯỢNG MÌNH CẦN? Cả hai trường hợp này đều chưa nghe bao giờ! Mà nếu bác không biết số lượng oligos, thì bác này cùn hơn em!!!
Cái này đúng là khó, may mà mình bỏ khoa học cũng lâu lâu rồi, chứ nếu không, với câu hỏi này của bác, thì chắc
rồi 
vỡ đầu mà chết mất (Ngồi nghĩ từ tối tới giờ không ra, không tìm được chỗ nào để giải thích mấy câu hỏi cũng như phương pháp của bác cả! Chết mất, chết mất)
Uhm, em học và làm cũng được một thời gian, nhưng cũng lần đầu tiên được hỏi bằng PCR người ta xác định được trong một tế bào có 2 hay 3 NST số 21 thì nên gọi là định tính hay định lượng??? Nói thật với bác, là em thì em nói ngay đó đơn giản nên gọi là chẩn đoán bệnh, và theo em hiểu nếu để làm thế, người ta đơn giản nhất là dùng multiplex PCR để chẩn đoán, mà chẳng liên quan gì tới định tính hay định lượng mà anh em mình đang bàn ở đây cả! Ở đây là tranh luận, không biết ý bác Ho Huu Tho là thế nào? Anh em trong 4rum cho ý kiến luôn cho rôm rả cái nào?
Cũng nói thật là, em bỏ khoa học được 3 năm, nhưng giờ tham gia với anh em mới thấy có khi mình đúng đắn! Chứ theo khoa học, mà ngồi ngâm cứu mấy câu như của các bác chắc, rồi cũng mà chết! Nói nghiêm túc là em thì không khoa học, thành thử độ cùn cao! Có sai sót gì thì mong anh chị em bà con cô bác cứ thẳng tay mà góp ý hộ em nhé! 
& cả nhà nhé!
Bình loạn lần chót với cái topic này! Trong 8 năm đi học và 3 năm đi làm ngoài, chưa ai hỏi em cũng như em thấy đề cập tới số lượng bản copy của phản ứng PCR cả! Người ta chỉ quan tâm tới nồng độ là chính thôi (và cái này cũng chỉ ước lượng, chứ cũng chẳng có phép đo nào cho một kết quả chính xác cả! Trong trường hợp cho kết quả chính xác, thì các bác cũng phải trừ đi lượng ADN ban đầu đưa vào, nghĩa là chi phí cao mà không cần thiết.còn quan tâm tới số lượng copy thì có realtime PCR), từ hàm lượng ADN của sản phẩm, người ta mới dùng nó để tiến hành các phản ứng tiếp theo (ligation, sequencing, hay các phản ứng lai ADN/Protein ..., Thành thử bác nào cho em một ví dụ nào về ứng dụng việc tính số bản sao chính xác của sản phẩm PCR, em sẽ comment tiếp các bác nhé!
Lần đầu tiên nghe nói là biết số-copy-tối-đa-của-sản-phẩm-PCR-là-bằng-số-copy-của-primer. Có thể em học không thấu, đọc chưa đến, nhưng nếu như thế thì hoạc là muốn tính được như bạn nói, thì (1) phải HỎI NHÀ TỔNG HỢP PRIMER về số lượng bản sao oligos được tổng hợp trong primer của bạn, hoạc (2) BẮT NHÀ TỔNG HỢP PHẢI TỔNG HỢP ĐÚNG SỐ LƯỢNG MÌNH CẦN? Cả hai trường hợp này đều chưa nghe bao giờ! Mà nếu bác không biết số lượng oligos, thì bác này cùn hơn em!!!
Cái này đúng là khó, may mà mình bỏ khoa học cũng lâu lâu rồi, chứ nếu không, với câu hỏi này của bác, thì chắc
rồi vỡ đầu mà chết mất (Ngồi nghĩ từ tối tới giờ không ra, không tìm được chỗ nào để giải thích mấy câu hỏi cũng như phương pháp của bác cả! Chết mất, chết mất)Uhm, em học và làm cũng được một thời gian, nhưng cũng lần đầu tiên được hỏi bằng PCR người ta xác định được trong một tế bào có 2 hay 3 NST số 21 thì nên gọi là định tính hay định lượng??? Nói thật với bác, là em thì em nói ngay đó đơn giản nên gọi là chẩn đoán bệnh, và theo em hiểu nếu để làm thế, người ta đơn giản nhất là dùng multiplex PCR để chẩn đoán, mà chẳng liên quan gì tới định tính hay định lượng mà anh em mình đang bàn ở đây cả! Ở đây là tranh luận, không biết ý bác Ho Huu Tho là thế nào? Anh em trong 4rum cho ý kiến luôn cho rôm rả cái nào?
Cũng nói thật là, em bỏ khoa học được 3 năm, nhưng giờ tham gia với anh em mới thấy có khi mình đúng đắn! Chứ theo khoa học, mà ngồi ngâm cứu mấy câu như của các bác chắc
, rồi cũng mà chết! Nói nghiêm túc là em thì không khoa học, thành thử độ cùn cao! Có sai sót gì thì mong anh chị em bà con cô bác cứ thẳng tay mà góp ý hộ em nhé! & cả nhà nhé!Bình loạn lần chót với cái topic này! Trong 8 năm đi học và 3 năm đi làm ngoài, chưa ai hỏi em cũng như em thấy đề cập tới số lượng bản copy của phản ứng PCR cả! Người ta chỉ quan tâm tới nồng độ là chính thôi (và cái này cũng chỉ ước lượng, chứ cũng chẳng có phép đo nào cho một kết quả chính xác cả! Trong trường hợp cho kết quả chính xác, thì các bác cũng phải trừ đi lượng ADN ban đầu đưa vào, nghĩa là chi phí cao mà không cần thiết.còn quan tâm tới số lượng copy thì có realtime PCR), từ hàm lượng ADN của sản phẩm, người ta mới dùng nó để tiến hành các phản ứng tiếp theo (ligation, sequencing, hay các phản ứng lai ADN/Protein ..., Thành thử bác nào cho em một ví dụ nào về ứng dụng việc tính số bản sao chính xác của sản phẩm PCR, em sẽ comment tiếp các bác nhé!
Ho Huu Tho
Senior Member
Type thoải mái đi, diễn đàn là nơi khuyến khích mọi người trao đổi, giả sử có cùn đi nữa thì cũng là do chưa sắc mà thôi. Cảm ơn voh5 đã làm cho topic này thêm nhiều phần hot nhé.
Có lẽ bạn lâu không làm nên không nhớ đó thôi, NHÀ TỔNG HỢP PRIMER luôn báo số bản sao oligos được tổng hợp trong primer của bạn.
Cái này đúng là ứng dụng để chẩn đoán, nhưng bản chất của nó là PCR định lượng (quantitative PCR) để định lượng trong tế bào có 2 hay 3 NST số 21 mà. Sao lại không liên quan nhỉ???
Cũng nói thật là, em bỏ khoa học được 3 năm, nhưng giờ tham gia với anh em mới thấy có khi mình đúng đắn! Chứ theo khoa học, mà ngồi ngâm cứu mấy câu như của các bác chắc
COLOR=black]Trong 8 năm đi học và 3 năm đi làm ngoài, chưa ai hỏi em cũng như em thấy đề cập tới số lượng bản copy của phản ứng PCR cả! Người ta chỉ quan tâm tới nồng độ là chính thôi (và cái này cũng chỉ ước lượng, chứ cũng chẳng có phép đo nào cho một kết quả chính xác cả!
Cái câu này mình vừa học được của ông thầy hướng dẫn, chắc ít nhiều giúp bạn nhớ lại thời gian đã từng làm khoa học "In science, it is critical to see what other people have ever seen and think about what other people have never thought".
voh5
Senior Member
>> Bác cho cái bản datasheet của thằng nào tổng hợp mồi cho bác cái? Em đi tổng hợp mồi từ 2004 tới nay chẳng bao giờ thấy nói tới số lương bản sao oligos được tổng hợp! Nếu thằng nào tổng hợp cho bác chắc em chuyển qua đấy em tổng hợp, chứ thằng Sigma Proligo ngu lắm, chỉ có vài thông tin chán òm!!!
Bản thân mình đoán, bác này sắp trúng quả to nếu tính được vụ này đấy! Khối thằng cần >> Lại phiền bác cho tí dẫn chứng đi? Em thấy bác toàn nói không thoi! Có bài báo hay công trình nào công bố mà có cái PCR (không phải là qPCR hay Realtime PCR nhé) để dùng chẩn đoán down được gọi là PCR định lượng không? Hay là người ta dùng PCR định lượng (qPCR = realtime PCR) để xác định hội chứng Down???
Hay, bác sắp sửa ra bài báo nhỉ?
Ho Huu Tho
Senior Member
Không biết voh5 nghĩ thế nào lại hạ bệ Sigma Proligo dã man vậy chứ, mình thấy đi học được cái ngu của cậu ấy cũng tạm gọi là sung túc rồi. Mình cũng từng đặt primer của Sigma Proligo, nếu có thời gian thì voh5 xem kỹ lại cái datasheet của cậu ấy xem có cái thông tin nào là không "chán òm" nhé.
Voh5 nói không thật lòng rồi.
Cái ví dụ mình đưa ra ở đây không phải là không có dẫn chứng, vi mình cũng đã trực tiếp làm về cái này, đã có bài báo công bố trong nước và đã triển khai thành xét nghiệm phục vụ bệnh nhân. Nhưng đưa ra dẫn chứng cụ thể ở đây thì tự thấy là không phù hợp nên không đưa ra mà thôi. Nếu voh5 thực sự quan tâm có thể tìm đọc Tạp chí Y học Việt Nam 2009 nhé.>> Lại phiền bác cho tí dẫn chứng đi? Em thấy bác toàn nói không thoi! Có bài báo hay công trình nào công bố mà có cái PCR (không phải là qPCR hay Realtime PCR nhé) để dùng chẩn đoán down được gọi là PCR định lượng không? Hay là người ta dùng PCR định lượng (qPCR = realtime PCR) để xác định hội chứng Down???
Similar threads
