PCR

[Hoàng Đức Minh]

I. Nguyên lý:
- Dựa vào khả năng biến tính và hồi tính của DNA bởi nhiệt độ (tăng giảm từ từ)
- Dựa vào vai trò của DNA polymerase.

II. Các yếu tố cần thiết của 1 phản ứng PCR
- Khuôn DNA
- Mồi
- Nu tự do
- DNA polymerase
- Dung dịch đệm

Theo em được biết có 9 phương pháp: Chuẩn, ngược, lồng, phức đảo, insiter, real time (còn 3 phương pháp nữa, ai biết thì bổ sung hộ em!)
Làm thế nào để phân biệt các phương pháp này. (có quyển nào viết về cái này ko nhỉ?)

3. Làm thế nào để phân biệt các kỹ thuật
- RAPD (Random Amplied polymorphism DNA: Đa hình di truyền các đoạn DNA được khuyếch đại ngẫu nhiên)
- RFLP ( Restriction Fragmenth Length polymophism DNA: Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn)
- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism DNA: Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuyếch đại chọn lọc)
- SSR (Simple Sequence Repeat: Khuyếch đại các đoạn lặp lại đơn giản)

 

[Đào Ngọc Thắng]

Mình biết một phương pháp nữa là Multiplex PCR.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Dựa vào khả năng biến tính và hồi tính của DNA bởi nhiệt độ (tăng giảm từ từ)

Cái "tăng giảm từ từ" ở đây là bạn muốn nói đến điều gì thế?? tăng từ từ, giảm từ từ nhiệt độ? Tự bạn nghĩ ra hay ở đâu nói?

Theo em được biết có 9 phương pháp: Chuẩn, ngược, lồng, phức đảo, insiter, real time (còn 3 phương pháp nữa, ai biết thì bổ sung hộ em!)
Làm thế nào để phân biệt các phương pháp này. (có quyển nào viết về cái này ko nhỉ?)

3. Làm thế nào để phân biệt các kỹ thuật
- RAPD (Random Amplied polymorphism DNA: Đa hình di truyền các đoạn DNA được khuyếch đại ngẫu nhiên)
- RFLP ( Restriction Fragmenth Length polymophism DNA: Đa hình chiều dài các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn)
- AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism DNA: Đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuyếch đại chọn lọc)
- SSR (Simple Sequence Repeat: Khuyếch đại các đoạn lặp lại đơn giản)

Nếu biết nguyên lý của các kỹ thuật này thì phân biệt được ngay.

insiter PCR là cái gì thế? Bạn định nói in situ???

Còn về số lượng thì không phải chỉ có 9 đâu.

 

[Hoàng Đức Minh]

Tăng nhiệt độ để biến tính DNA(đến 94-95 độ C, hai mạch tách rời), giảm nhiệt độ (đến 62 độ, cặp mồi liên kết với DNA khuôn), tăng nhiệt độ đến 72 độ (tổng hợp mạch DNA mới theo nguyên tắc bổ sung). Quá trình cứ tiếp diễn như vậy từ 25 đến 35 chu kỳ.

Phải tăng hay giảm từ từ vì nếu đột ngột làm DNA mất khả năng biến tính hoặc hồi tính mà cuộn xoắn lại, mất cấu trúc.Tại các nhà khoa học chưa phát hiện ra đầy đủ các enzym trong quá trình tự nhân đôi của DNA chứ ko thì việc gì phải tăng giảm nhiệt độ như thế (lúc tìm ra được thì tiến hành luôn ở nhiệt độ thường như trong cơ thể sinh vật ấy, tốc độ tổng hợp lại cao hơn rất nhiều đến hàng ngàn nu/giây).

Tất nhiên là em biết nguyên lý của các kỹ thuật rồi, nhưng ko phân biệt nổi nên mới hỏi. Em có cần chép đầy đủ nguyên lý ra ko ạ?

Vậy số lượng các pp PCR là bao nhiêu? Anh chỉ cho em với (có chú thích thuật ngữ tiếng Anh)

Em chưa nhìn thấy máy PCR bao giờ, và cũng chưa bao giờ làm nên ko rõ mới phải hỏi, chứ nếu em làm rồi và rõ rồi thì hỏi làm gì?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Phải tăng hay giảm từ từ vì nếu đột ngột làm DNA mất khả năng biến tính hoặc hồi tính mà cuộn xoắn lại, mất cấu trúc.Tại các nhà khoa học chưa phát hiện ra đầy đủ các enzym trong quá trình tự nhân đôi của DNA chứ ko thì việc gì phải tăng giảm nhiệt độ như thế (lúc tìm ra được thì tiến hành luôn ở nhiệt độ thường như trong cơ thể sinh vật ấy, tốc độ tổng hợp lại cao hơn rất nhiều đến hàng ngàn nu/giây).

Xem lại nhé. Một trong các tiêu chuẩn khi chọn máy PCR là thời gian gia nhiệt. Cái này người ta lại cần càng nhanh càng tốt. Cậu đã nghe nói chạy PCR bằng ... tay chưa?

Lấy 3 cái bể ổn nhiệt, 1 cái 94, 1 cái 72, 1 cái 55 (hoặc bao nhiêu đó tùy nhiệt độ gắn mồi). Làm cái que móc vào cái eppendorf, kiếm 1 cái đồng hồ bấm giờ, ok, đúng giờ ta nhấc từ bể nọ sang bể kia (hơi mệt chút vì phải đứng cả tiếng với nó). Đấy, tăng giảm nhiệt như vậy là rất đột ngột nhé, vậy mà kết quả đôi khi còn tốt hơn dùng máy mới kỳ (chỉ tội mất thời gian quá thôi ).

Cho dù có tìm ra hết các Ez trong quá trình tự nhân đôi của DNA người ta cũng vẫn dùng nguyên lý PCR như vậy thôi không thì chết bà con khi làm tối ưu à.

Tất nhiên là em biết nguyên lý của các kỹ thuật rồi, nhưng ko phân biệt nổi nên mới hỏi. Em có cần chép đầy đủ nguyên lý ra ko ạ?

Cứ từ từ suy ngẫm.

Vậy số lượng các pp PCR là bao nhiêu? Anh chỉ cho em với (có chú thích thuật ngữ tiếng Anh)

Số lượng bao nhiêu thì tôi không biết vì chưa đếm, với lại nó phát triển liên tục, ngoài mấy cái bạn đã kể, liệt kê mấy cái tôi còn nhớ nhé: megaprimer PCR, degenerated oligonucleotide-primed PCR, direct and indirect in situ PCR, touchdown PCR, long PCR, ngoài ra người ta còn kết hợp các kỹ thuật PCR để cho ra nested RT-PCR, RT in situ PCR...

Cứ từ từ, nắm chắc một vấn đề rồi hãy chuyển sang vấn đề khác.

 

[Hoàng Đức Minh]

Em ko hiểu cái từ "đôi khi còn tốt hơn" của anh, tốt hơn trong phần lớn các trường hợp thử nghiệm hay là như thế nào khác?

Chế độ thay đổi nhiệt trong các máy PCR như thế nào ạ? Thay đổi nhiệt thông qua một dung dịch hay là thay đổi nhiệt trực tiếp từ ống nghiệm cần nhân.

Hà hà, nếu mà tinh chế được enzym cắt liên kết Hydro (chứ ko dùng nhiệt độ như ngày nay) thì tốc độ xấp xỉ bằng trong tế bào rồi. Enzym là chất xúc tác số 1 rồi, anh còn phải tối ưu làm quái gì cho mệt nữa (chỉ sợ ko đủ tiền mua mà phải ngồi tối ưu theo cách này thôi)

Khi dùng PCR thì đoạn cần nhân có kích thước bao nhiêu là hiệu quả? Vì nếu tăng hay giảm nhiệt độ đột ngột như thế thì ko bao giờ đoạn cần nhân có thể quá dài được.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em ko hiểu cái từ "đôi khi còn tốt hơn" của anh, tốt hơn trong phần lớn các trường hợp thử nghiệm hay là như thế nào khác?

Lấy một mẫu DNA, mang đi PCR bằng cả 2 phương pháp, dùng máy PCR và dùng bể ổn nhiệt. Nhiều trường hợp sau khi điện di thì cái mẫu dùng bể ổn nhiệt cho băng đậm hơn.

Chế độ thay đổi nhiệt trong các máy PCR như thế nào ạ? Thay đổi nhiệt thông qua một dung dịch hay là thay đổi nhiệt trực tiếp từ ống nghiệm cần nhân.

Nhảy vô cái lab của bạn hoặc bảo giáo viên cho xem cái máy PCR là biết liền.

Hà hà, nếu mà tinh chế được enzym cắt liên kết Hydro (chứ ko dùng nhiệt độ như ngày nay) thì tốc độ xấp xỉ bằng trong tế bào rồi. Enzym là chất xúc tác số 1 rồi, anh còn phải tối ưu làm quái gì cho mệt nữa (chỉ sợ ko đủ tiền mua mà phải ngồi tối ưu theo cách này thôi)

Trời ạ. Cứ cho cậu có một enzyme chỉ cắt liên kết H giữa các base N mà không cắt các chỗ khác thì nhiệt độ tối ưu cho enzyme đó là bao nhiêu, cần bao nhiêu Unit cho một phản ứng (với các template ?khác nhau chắc chắn lượng enzyme sẽ khác nhau), nhiệt độ hoạt động của nó so với nhiệt độ hoạt động của Taq ra sao... Lý thuyết khác xa thực tiễn. Cho dù với PCR chuẩn, người ta đã nghiên cứu nát ra rồi, có các chương trình giả lập với nồng độ các chất cho vào bao nhiêu, nhiệt độ các chu kỳ là bao nhiêu... thì cho ra sản phẩm tốt hay không tốt, nhưng vẫn phải làm thực nghiệm.

Khi dùng PCR thì đoạn cần nhân có kích thước bao nhiêu là hiệu quả? Vì nếu tăng hay giảm nhiệt độ đột ngột như thế thì ko bao giờ đoạn cần nhân có thể quá dài được.

Cái này còn tùy dùng protocol PCR nào. Đúng là đoạn cần nhân không thể quá dài được nhưng lý do không phải là do tăng giảm nhiệt độ đột ngột mà do khả năng của polymerase.

Tốt nhất cậu nên xem người ta làm thực nghiệm một lần rồi hãy tranh luận tiếp.

 

[Hoàng Đức Minh]

Nguyên lý:
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/PCR.html

Trang rất hay về PCR http://www.horizonpress.com/pcr/

 

[Bùi Thúy Nga]

Em muốn hỏi về "mồi" trong PCR. Mồi này là do mình tự tạo ra fải ko ah? Làm thế nào có thể tổng hợp được mồi nếu ko biết trình tự của mạch? 8O .
Tại sao lại gọi là "khuếch đại" trong khi PCR chỉ là "nhân nhanh" thôi mà, theo em hiểu và thấy (qua hình ảnh) thì chỉ là nhân nhanh DNA chứ có thấy nó phóng to đâu mà gọi là khuếch đại ah?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em muốn hỏi về "mồi" trong PCR. Mồi này là do mình tự tạo ra fải ko ah? Làm thế nào có thể tổng hợp được mồi nếu ko biết trình tự của mạch?

Đúng vậy, nếu không biết trình tự thì không tổng hợp được mồi. Còn biết rồi thì cứ đưa cái trình tự cho thằng bán mồi, nó sẽ tổng hợp cho.

Tại sao lại gọi là "khuếch đại" trong khi PCR chỉ là "nhân nhanh" thôi mà, theo em hiểu và thấy (qua hình ảnh) thì chỉ là nhân nhanh DNA chứ có thấy nó phóng to đâu mà gọi là khuếch đại ah?

Khuếch đại ở đây ý muốn nói là số lượng (số bản sao), không phải chiều dài trình tự.

 

[Trần Hoàng Dũng]

cái vụ khuyếch đại là do dịch từ chữ amplification. mà em mở tự điển ra sẽ thấy nghĩa của nó. Em nghe nhạc, có dàn "am -li" giúp em khuyếch đại âm thanh lên nghe cho ... đã chứ nó có "nhân nhanh" âm thanh cho em đâu.

 

[Hoàng Đức Minh]

Các anh thử đưa một protocol mà mình hay làm nhất biết rõ kết quả nhất lên đây rồi cho em thử phân tích mục đích của từng bước, các chú ý khi làm các bước đấy, rồi các anh sửa lại có được không? Vì không phải ai cũng có điều kiện nhìn và làm trực tiếp với máy PCR, có phân tích, có thắc mắc như vậy, có sai như thế thì hiểu mới nhanh được, chứ ngồi mà bàn như thế này thì đời nào em mới hiểu nổi. Cứ đọc protocol, thắc mắc hết mức, rồi nhảy vào làm là hiểu nhanh lắm. Cho bọn em tên máy nữa nhé.

Biết đâu em thắc mắc các chỗ mà các anh, các chị không bao giờ để ý hay hỏi tại sao thì sao? He he, lúc đấy thì nhiều chuyện hay lắm, giải thích cho bọn em thì các anh các chị hiểu sâu sắc hơn. Các anh các chị đồng ý chứ?

 

[Phạm Quỳnh Anh]

Bạn Minh chép ra các nguyên lý của các phương pháp marker phân tử đi, mình sẽ giúp bạn phân biệt chúng.

 

[Hoàng Đức Minh]

he he, gần đây mới tìm được một cái link khá hay về pcr. Giải đáp câu hỏi từ lâu có bao nhiêu loại pcr.

http://www.pcrlinks.com/

.AFLP
·Alu-PCR
·Asymmetric PCR
·Colony PCR
·DD-PCR
·Degenerate PCR
·Hot-start
·In situ PCR
·Inverse PCR
·Long-PCR
·Multiplex PCR
·Nested PCR
·PCR-ELISA
·PCR-RFLP
·PCR-SSCP
·QC-PCR
·RACE
·RAPD
·Real-Time PCR
·Rep-PCR
·RT-PCR
·TAIL-PCR [NEW]
·Touchdown PCR
·Vectorette PCR

 

[Dương Văn Cường]

Đúng vậy, nếu không biết trình tự thì không tổng hợp được mồi. Còn biết rồi thì cứ đưa cái trình tự cho thằng bán mồi, nó sẽ tổng hợp cho.

Hì hì, vấn đề là cái thằng bán mồi (nghe giống dân bợm nhậu quá nhể) nó tổng hợp thế nào? Em SV nào lên google giải quyết câu hỏi này đi, nếu tất cả cùng lười thì đợi lúc nào tớ máu lên tớ tìm hiểu rồi giải thích cho (hơi lâu đấy). ?

 

[Dương Văn Cường]

Đây là link đến bài giải thích rất rõ ràng về cách tổng hợp oligonucleotide:

http://www.bio.davidson.edu/Courses...ng2003/Holmberg/oligonucleotide_synthesis.htm

Bạn nào dịch giúp sang tiếng Việt để đưa lên index nhé

 

[0928454220]

Pcr

Cho em xin tài liệu về Touchdown PCR. Em cảm
ơn nhiều ạ

 

[duybio]

Em ko hiểu cái từ "đôi khi còn tốt hơn" của anh, tốt hơn trong phần lớn các trường hợp thử nghiệm hay là như thế nào khác?

Chế độ thay đổi nhiệt trong các máy PCR như thế nào ạ? Thay đổi nhiệt thông qua một dung dịch hay là thay đổi nhiệt trực tiếp từ ống nghiệm cần nhân.

Hà hà, nếu mà tinh chế được enzym cắt liên kết Hydro (chứ ko dùng nhiệt độ như ngày nay) thì tốc độ xấp xỉ bằng trong tế bào rồi. Enzym là chất xúc tác số 1 rồi, anh còn phải tối ưu làm quái gì cho mệt nữa (chỉ sợ ko đủ tiền mua mà phải ngồi tối ưu theo cách này thôi)

Khi dùng PCR thì đoạn cần nhân có kích thước bao nhiêu là hiệu quả? Vì nếu tăng hay giảm nhiệt độ đột ngột như thế thì ko bao giờ đoạn cần nhân có thể quá dài được.

Chế độ thay đổi nhiệt trong các máy PCR như thế nào ạ? Thay đổi nhiệt thông qua một dung dịch hay là thay đổi nhiệt trực tiếp từ ống nghiệm cần nhân.

TL: Máy PCR có block gia nhiệt đặt dưới, ống PCR đặt trong block gia nhiệt. sẽ có heater gia nhiệ trực tiếp qua block gia nhiệt, rồi gia nhiệt qua ống PCR. Không có gia nhiệt qua dung dịch đâu bạn ạ, vì như thế có khả năng gây nhiễm vào mẫu trong ống PCR.