Testing primer trên

[biotech]

mình đang muốn kiểm tra primer của mình có khuếch đại hiệu quả đoạn gene mong muốn không? nhưng mình lại không biết sử dụng như thế nào cho đúng, đã thử rồi nhưng không ra.
primer của mình :
KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’
KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’
khuếch đại đoạn gene KMT1 khẳng định Pasteurella multocida
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
mong được sự giúp đỡ của mọi người

 

[happyfly]

Mình vừa tra xong, có ra kq như ảnh.
Bạn nhớ tich vào other trong đoạn này
Human genomic + transcript Mouse genomic + transcript Others (nr etc.):

 

[biotech]

Mình vừa tra xong, có ra kq như ảnh.
Bạn nhớ tich vào other trong đoạn này
Human genomic + transcript Mouse genomic + transcript Others (nr etc.):

Bạn ơi, mình testing primer bằng primer-BLAST đó. không phải bằng blastn đâu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd
bằng cách blastn chỉ cho quá nhiều kết quả không test chính xác primer được.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

mình đang muốn kiểm tra primer của mình có khuếch đại hiệu quả đoạn gene mong muốn không? nhưng mình lại không biết sử dụng như thế nào cho đúng, đã thử rồi nhưng không ra.
primer của mình :
KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’
KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’
khuếch đại đoạn gene KMT1 khẳng định Pasteurella multocida
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
mong được sự giúp đỡ của mọi người

Không cần test làm gì cho mệt. Cứ dùng phần mềm design rồi PCR thôi.

 

[Đinh Duy Thành]

Không cần test làm gì cho mệt. Cứ dùng phần mềm design rồi PCR thôi.

Cũng tùy mục đích nữa anh ạ Bọn em khi thiết kế mồi chẩn đoán mầm bệnh luôn phải đảm bảo đoạn thiết kế của mình rơi vào vùng conserved nhất trong genome của loài cần tìm, lại phải không bắt nhầm sang thằng khác Hoặc khi thiết kế mồi để xác định polymorphism trên một đối tượng nào đấy lại để cho vùng bắt cặp rơi đúng vào vị trí đa hình thì...
Kinh nghiệm của em trong mấy cái này mới nhích khỏi zero một tí tẹo. Đến giờ em cũng mới chỉ biết dùng blastn và primer-blast thôi, sau đó ngồi lọ mọ đọc từng thằng một trong số kết quả đấy (chú ý khoảng cách giữa 2 vị trí bắt cặp cùng với hướng 5'-3' của mỗi đoạn mồi)... nói chung là quy trình công nghệ hết sức tiền sử và ^%$#@! Không biết bác biotech có trong cùng cảnh ngộ giống em không?

Rất mong nhận được những lời khuyên quý báu của các bác!

 

[happyfly]

Bạn ơi, mình testing primer bằng primer-BLAST đó. không phải bằng blastn đâu
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd
bằng cách blastn chỉ cho quá nhiều kết quả không test chính xác primer được.

cái này mình ko hiểu rùi. cũng ko biết là với mồi với mục đích khác nhau thì phải có phương pháp kiểm tra khác nhau nữa cơ :hum:. hồi trc mình làm realtime pcr, dùng cái này cũng ổn. trình còi nên chỉ biết tới vậy thui .

bạn mình cũng đã hướng dẫn mình cách là tìm vùng bảo thủ rồi từ đó mới thiết kế, vẫn kiểm tra lại bằng blast. làm thử mấy cái vẫn thấy ngon ngon. cái này thì chưa đem mồi đi chạy thử bao giờ nên ko hiểu còn nảy sinh vấn đề gì nữa.

 

[biotech]

cái này mình ko hiểu rùi. cũng ko biết là với mồi với mục đích khác nhau thì phải có phương pháp kiểm tra khác
bạn mình cũng đã hướng dẫn mình cách là tìm vùng bảo thủ rồi từ đó mới thiết kế, vẫn kiểm tra lại bằng blast. làm thử mấy cái vẫn thấy ngon ngon. cái này thì chưa đem mồi đi chạy thử bao giờ nên ko hiểu còn nảy sinh vấn đề gì nữa.

trời ơi. tôi thấy chương trình này mới,có hiệu quả cao hơn. nếu bạn mua một cặp mồi của nhà sản xuất, trình tự đã có sẵn trên các bài báo khoa học, có cả tên của gene khuếch đại. Bạn muốn kiểm tra cặp primer đó? bằng cách dùng blastn. xưa rồi.dùng như vậy phải ngồi tìm kiếm, phân tích. tại sao không dùng thử primer-blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd
cùng tìm hiểu và khám phá nó nhé. Mong được sự quan tâm của mọi người

 

[happyfly]

trời ơi. tôi thấy chương trình này mới,có hiệu quả cao hơn. nếu bạn mua một cặp mồi của nhà sản xuất, trình tự đã có sẵn trên các bài báo khoa học, có cả tên của gene khuếch đại. Bạn muốn kiểm tra cặp primer đó? bằng cách dùng blastn. xưa rồi.dùng như vậy phải ngồi tìm kiếm, phân tích. tại sao không dùng thử primer-blast
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHomeAd
cùng tìm hiểu và khám phá nó nhé. Mong được sự quan tâm của mọi người

okie thui. bao giờ ngồi thiết kế sẽ sờ lại cái này.
vấn đề là tui dễ bỏ nghề quá . chỉ bới vàng tìm cát trong mớ kiến thức cũ.

lần sau bạn làm đc những gì thì nên nói luôn cho mọi người rõ. kẻo tôi là trứng lại ọ ọe đi ra giúp vịt. xấu hổ chít .

 

[Dương Văn Cường]

Mình chưa từng có negative experience với PCR. Design primer trên lý thuyết thì khá là rách việc nhưng trên thực tế cứ copy hai đầu đoạn cần khuếch đại, treo thêm cái RE xong là chạy phằm phằm. Nghe có vẻ khó tin nhưng khi mình làm thì template là plasmid hay Arabidopsis genome cũng như nhau. Thậm chí program cũng lười không thèm tính cứ dùng vài saved progs mà chạy.

Vì vậy lời khuyên với bạn (nếu ở nước ngoài) là cứ order primer và chạy thử đi đã, failed thì tính tiếp. Nếu ở trong nước mà điều kiện tài chính eo hẹp đặt cái primer cũng phải kính trình thì

Khó nhất là nhân một đoạn gene của virus mà template là DNA tổng số của infected cell. Hồi đó các anh chị ở lab mình mất mấy tháng mới thành công. Khi ấy mình là undergrad lên lab rửa dụng cụ là chính nên coi như không có kinh nghiệm luôn.

 

[khoics11]

Design primer trên lý thuyết thì khá là rách việc nhưng trên thực tế cứ copy hai đầu đoạn cần khuếch đại, treo thêm cái RE xong là chạy phằm phằm.

Nói thật với anh là em không dám tin cách làm của anh. Nếu đúng như anh nói thì mấy ông GS.TS ngồi nghĩ ra mấy các thuật toán, phần mềm thiết kế để làm gì? Rồi mấy người bỏ tiền triệu ra mua mấy phần mềm đó về sử dụng để làm gì?

Anh chưa từng gặp negative results với PCR vì có lẽ anh chỉ làm với PCR thông thường và gặp...may kinh khủng. Nếu anh làm với Real-time PCR hay những thứ cao cấp hơn thì có ngày anh...lỗ vốn nặng lắm đó.