Làm thế nào để sequencing sản phẩm RAPD tốn ít công nhất?

[quang]

Anh em thân mến, cả năm nay bỏ bê molecular lab vì mải mê với cái món di truyền số lượng nên không còn update mấy cái technique nữa có vấn đề này mong anh em khuyên bảo: Làm thế nào để thu được trình tự nucleotide của một sản phẩm PCR nhân lên bằng mồi RAPD mà không thông qua việc clone vào vector? Vì mục đích là phải sequence vô cùng nhiều band của RAPD nhằm tìm kiếm các trình tự của transposom ở loài nghiên cứu nên cloning sản phẩm của RAPD thì tốn quá nhiều công sức. Mong được sự cố vấn của anh em. Thân ái.

 

[viet23ht]

Đề xuất là sequence trực tiếp sản phẩm PCR, sau đó thiết kế mồi lồng từ những trình tự thu được.

 

[quang]

RAPD-sequencing

Đề xuất là sequence trực tiếp sản phẩm PCR, sau đó thiết kế mồi lồng từ những trình tự thu được.

Merci bác đã cố vấn, cái direct sequencing từ band của phản ứng RAPD cắt ra từ Gel em đã thử, kết quả là không thu được các peak rõ ràng và đa số là không có peak, em đoán chắc là do sequencing reaction thất bại. Số mẫu thu được có peak như mong muốn rất rất ít. Em đoán là do cái primer của RAPD nó ngắn (khoảng 10 bp) nên khi chạy sequencing reaction nó bắt cặp lung tung vào cái DNA template cho nên không phản ứng được, đoán thế thôi, chả biết chính xác là do đâu, lâu ngày không làm thí nghiệm DNA giờ thấy ngại suy nghĩ quá. Bác có ý kiến gì chỉ bảo em thêm nhé.

 

[Nguyễn Phước Hùng]

Merci bác đã cố vấn, cái direct sequencing từ band của phản ứng RAPD cắt ra từ Gel em đã thử, kết quả là không thu được các peak rõ ràng và đa số là không có peak, em đoán chắc là do sequencing reaction thất bại. Số mẫu thu được có peak như mong muốn rất rất ít. Em đoán là do cái primer của RAPD nó ngắn (khoảng 10 bp) nên khi chạy sequencing reaction nó bắt cặp lung tung vào cái DNA template cho nên không phản ứng được, đoán thế thôi, chả biết chính xác là do đâu, lâu ngày không làm thí nghiệm DNA giờ thấy ngại suy nghĩ quá. Bác có ý kiến gì chỉ bảo em thêm nhé.

Theo em, bác tinh chế PCR product qua gel ma sau khi sequencing không có peak, chứng tỏ nồng độ DNA sau tinh chế quá thấp hay không có. Primer cho RAPD đúng là ngắn khoảng 10bp nhưng nó vẫn đủ bắt cặp với template và có những mẫu cho kết quả với peak rất tốt==> primer đó có thể sài cho sequencing được.

Bản thân RAPD nó đã không có độ tin cậy cao rồi, kết quả PCR cũng không có đồng nhất, nhiều band nên nồng độ của mỗi band lại thấp nên tinh chế được sẽ rất ít. Nếu muốn check, bác PCR với thể tích lớn hơn rồi tinh chế qua gel và thu band cần check và sequencing thử xem và so sánh. Nếu cũng không có peak thì chỉ còn lại do primer. KHi đó phải sài đến 3"-extension primer.

 

[Nguyễn Phước Hùng]

Quên mất, gủi anh bài paper đó đây. Cái vụ này người ta làm có hiệu quả ok lắm, bác dùng bộ kit sequencing với big dye PCR của applie biosystem là check thoải mái.
http://www.box.net/shared/z510cjf7mx

 

[quang]

Quên mất, gủi anh bài paper đó đây. Cái vụ này người ta làm có hiệu quả ok lắm, bác dùng bộ kit sequencing với big dye PCR của applie biosystem là check thoải mái.
http://www.box.net/shared/z510cjf7mx

Merci Hùng, mình cũng đang ngâm cứu cái thằng 3'-ext primer, chắc phải dùng cái này, vấn đề là phải sequence đến hàng ngàn band nên thấy ngại quá. Thôi cố vậy sang năm về rồi sẽ bỏ được máy mon molecular này làm quantitative thích hơn. Cám ơn nhiều.

 

[Trịnh Thành Trung]

Merci Hùng, mình cũng đang ngâm cứu cái thằng 3'-ext primer, chắc phải dùng cái này, vấn đề là phải sequence đến hàng ngàn band nên thấy ngại quá. Thôi cố vậy sang năm về rồi sẽ bỏ được máy mon molecular này làm quantitative thích hơn. Cám ơn nhiều.

Chào Quang,

Quang đang lam trên đối tượng nào thế? Mục đích nghiên cứu là gì? có thể nói để AE biết được không? Mình đoán cậu đang nghiên cứu liên quan đến vấn đề Horizontal Gene Transfer?

 

[quang]

Chào Quang,

Quang đang lam trên đối tượng nào thế? Mục đích nghiên cứu là gì? có thể nói để AE biết được không? Mình đoán cậu đang nghiên cứu liên quan đến vấn đề Horizontal Gene Transfer?

Chào Trung, mình đang làm trên đối tượng loài thực vật hoang dại trong rừng của Nhật ý mà. Đang làm về lĩnh vực evolutionary (population) genetics, chỉ dùng transposon làm marker thôi chư không thiên về cái horizontal transfer. Trung ở bên CNSH DHQG à? hàng xóm rồi.

 

[viet23ht]

Nếu thế thì hàm lượng ADN sau PCR bị thấp, em dùng bộ Kit tinh sạch xong thì tủa cồn để làm tăng nồng độ ADN. Như thế thì hiệu quả sequence sẽ được cải thiện đáng kể đấy.
Vấn đề là mồi ngẫu nhiên cũng phải có trình tự thì mới mong làm mồi lồng được.
Chúc may mắn.
(Đấy là kinh nghiệm của anh chạy trên máy và hoá chất của ABI.)

 

[Trịnh Thành Trung]

Chào Trung, mình đang làm trên đối tượng loài thực vật hoang dại trong rừng của Nhật ý mà. Đang làm về lĩnh vực evolutionary (population) genetics, chỉ dùng transposon làm marker thôi chư không thiên về cái horizontal transfer. Trung ở bên CNSH DHQG à? hàng xóm rồi.

Quang làm ở đâu? mình xem profile mà không thấy.

Nhưng cũng mường tượng thấy công việc của cậu khó khăn nhỉ? Thôi thì thí nghiệm dựa trên "random" thì kết quả cũng phải "random" thôi. Trước khi làm thì phải chắp tay lạy tứ phía mới mong kết tốt được :d , Mà chẳng nhẽ không còn phương pháp nào trong nghiên cứu về cái tranposon đó sao? Bác nào có kinh về lĩnh vực này thì nghiệm cho anh em một chút.

have fun

 

[quang]

Đã có kết quả direct sequencing sản phẩm RAPD. Nếu dùng 1 primer như đã được sử dụng để amplify trong PCR đầu tiên vào PCR để sequencing reaction thì thường không có phản ứng vì primer của RAPD bắt cặp vào cả 2 đầu của template DNA >>> loại bỏ khả năng sequencing trực tiếp này. Đã dùng thử phương pháp 3"-ext primer mà Hùng giới thiệu, nhưng thời gian và công sức bỏ ra để sequencing 1 sản phẩm RAPD cũng không kém gì so với subcloning. Balance giữa trade-off của thời gian + công sức với tiền bạc, subcloning đã được chọn để sequencing, bởi vì no better way.

 

[quang]

Ai có ý tưởng gì xin chỉ giáo giùm nhé. Sẽ có thanks và hậu tạ.

 

[Trịnh Thành Trung]

Ai có ý tưởng gì xin chỉ giáo giùm nhé. Sẽ có thanks và hậu tạ.

Sau khi RAPD xong thì số lượng band trên Gel có nhiều không? các band phân tách nhau có rõ ràng không? kích thước các band giao động trong khoảng nào? (chắc chắn là phải tương đối lớn để nó cover cả cái Tn vì kích thước của một Tn cũng tương đối lớn thì phải (Tn5 ~10kb ), còn kích thước của một IS thì nhỏ hơn nhưng chí ít cũng phải trên 1,5kb). Tính reproducibility của RAPD có ổn không? Hơn nữa, nếu dùng 1 primer thì cũng không nói hết lên mô hình hay vị trí phân bố của IS trong genome thì phải?

Ước gì kiếm được chú RE nào cắt cái đoạn cần sequence đó ra làm đôi, hoặc làm 3, 4 cũng được. Giải trình tự mấy đoạn cắt ra đấy thì chí ít cũng được 1 đoạn forward và 1 đoạn reverse. Phần còn lại giải quyết bằng walking primer thì phải?

Đã có nghiên cứu cụ thể về Tn trên đối tượng Quang nghiên cứu chưa? nếu rồi, sử dụng Southern blot nghiên cứu có được ko nhi?

 

[quang]

Sau khi RAPD xong thì số lượng band trên Gel có nhiều không? các band phân tách nhau có rõ ràng không? kích thước các band giao động trong khoảng nào? (chắc chắn là phải tương đối lớn để nó cover cả cái Tn vì kích thước của một Tn cũng tương đối lớn thì phải (Tn5 ~10kb ), còn kích thước của một IS thì nhỏ hơn nhưng chí ít cũng phải trên 1,5kb). Tính reproducibility của RAPD có ổn không? Hơn nữa, nếu dùng 1 primer thì cũng không nói hết lên mô hình hay vị trí phân bố của IS trong genome thì phải?

Ước gì kiếm được chú RE nào cắt cái đoạn cần sequence đó ra làm đôi, hoặc làm 3, 4 cũng được. Giải trình tự mấy đoạn cắt ra đấy thì chí ít cũng được 1 đoạn forward và 1 đoạn reverse. Phần còn lại giải quyết bằng walking primer thì phải?

Đã có nghiên cứu cụ thể về Tn trên đối tượng Quang nghiên cứu chưa? nếu rồi, sử dụng Southern blot nghiên cứu có được ko nhi?

Trung mến,
#1. Kích thước của fragment và repeatability của RAPD cũng như nồng độ DNA không là vấn đề lớn trong thí nghiệm của mình vì tất cả những thứ đó có thể dễ dàng khắc phục. Vấn đề lớn nhất là: làm thế nào để đọc được trình tự nucleotide của một band nhân lên từ RAPD mà không cần clone nó vào vector. Mình đã thử direct sequencing, tức là dùng chính cái primer đã được sử dụng trong phản ứng RAPD để nhân cái band đó lên vào sequencing reaction nhưng không được. Đây là việc làm stupid nhất mình đã làm vì cái primer được dùng sẽ match vào cả 2 đầu của DNA fragment nên phản ứng không thể xảy ra (loại bỏ phương pháp này). Sử dụng 3"-extension primer thì sẽ có thể direct sequencing RAPD được, kỹ thuật này tuy rẻ hơn nhưng thời gian và công sức bỏ ra cũng không kém gì so với subcloning, tiền thì mình không thiếu (nhưng không được cho vào túi và thuê người khác làm, paradox!!) chỉ thiếu thời gian và sức lực.
#2. Chưa có data nào về cái này ở loài mình nghiên cứu, thực vật hoang dại mà. CŨng có thể tính đến kỹ thuật blotting dựa trên các probe có trình tự là các conserved regions ở ở các loài khác, hoặc degenerate primers, vv nhưng mình vẫn muốn dùng RAPD để tìm kiếm vùng DNA cần quan tâm hơn vì mục đích là di truyền quần thể mà.

 

[Trịnh Thành Trung]

Theo mình tờ lờ mờ hiểu thì cái đích mà Quang đang theo đuổi thì việc đầu tiên là cần phải tìm ra sự khác biệt về DNA banding pattern giữa các cá thể sau khi RAPD. Tiếp theo là phải tìm ra được Tn trong các band khác biệt đó (giải quyết bằng sequencing?). Nếu cái reproducibility là ổn rồi thì cái quan trọng nhất quyết định số phận cho thí nghiệm (work or not) phải là cái arbitrary primer. Do đó, Quang phải chạy mẫu trên nhiều loại arbitrary primer trong quá trình screening? (screening cho Tn chứ không phải screening cho arbitrary primer để develop RAPD method for typing)

Subcloning là phương pháp đơn giản, không tốn nhiều thời gian lắm nếu làm đồng loạt trên một lượng lớn mẫu (tất nhiên không thể so sánh được với các phương pháp mang tính high-throughput được). Có gì đâu phải ngần ngại cái bước này?

P/S: Trong các phương pháp typing giữa cá cá thể cùng loài thì RAPD được coi là phương pháp tiết kiệm kinh tế nhất nhưng kết quả lại phập phù nhất (vs ribotype, RFLP, AFLP, PFGE or MLST). Nếu cậu có bí quyết gì để giải quyết cái sự phập phù đó thì hôm nào rảnh chia sẻ cho anh em xem với nhé.

 

[Luyện Quốc Hải]

Anh em thân mến, cả năm nay bỏ bê molecular lab vì mải mê với cái món di truyền số lượng nên không còn update mấy cái technique nữa có vấn đề này mong anh em khuyên bảo: Làm thế nào để thu được trình tự nucleotide của một sản phẩm PCR nhân lên bằng mồi RAPD mà không thông qua việc clone vào vector? Vì mục đích là phải sequence vô cùng nhiều band của RAPD nhằm tìm kiếm các trình tự của transposom ở loài nghiên cứu nên cloning sản phẩm của RAPD thì tốn quá nhiều công sức. Mong được sự cố vấn của anh em. Thân ái.

Xin hỏi quang 1 vấn đề, Bạn đang làm về QTLs à? Mình đang tìm hiểu về vấn đề này, có gì chỉ bảo thêm nhé.
Còn về vấn đề của bạn, Chỉ nghĩ đến việc dùng sản phẩm của RAPD để direct sequencing là thấy mệt rồi. Tính khả thi, mình nghĩ sẽ không cao đâu.
Mục đích của bạn là tìm ra trình tự của cảc Transposon. Vậy hãy liên hệ với nghiên cứu này xem sao. (sử dụng kỹ thuật AFLP)http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Pages1&go=page&pid=4

P/S: bạn giới thiệu cho mình cách sử dụng phần mềm MAPMAKER/EXP và MAPMAKER/QTL nhé. Có Software thì share luôn nhé.
Thân chào.

 

[quang]

Theo mình tờ lờ mờ hiểu thì cái đích mà Quang đang theo đuổi thì việc đầu tiên là cần phải tìm ra sự khác biệt về DNA banding pattern giữa các cá thể sau khi RAPD. Tiếp theo là phải tìm ra được Tn trong các band khác biệt đó (giải quyết bằng sequencing?). Nếu cái reproducibility là ổn rồi thì cái quan trọng nhất quyết định số phận cho thí nghiệm (work or not) phải là cái arbitrary primer. Do đó, Quang phải chạy mẫu trên nhiều loại arbitrary primer trong quá trình screening? (screening cho Tn chứ không phải screening cho arbitrary primer để develop RAPD method for typing)

Subcloning là phương pháp đơn giản, không tốn nhiều thời gian lắm nếu làm đồng loạt trên một lượng lớn mẫu (tất nhiên không thể so sánh được với các phương pháp mang tính high-throughput được). Có gì đâu phải ngần ngại cái bước này?

P/S: Trong các phương pháp typing giữa cá cá thể cùng loài thì RAPD được coi là phương pháp tiết kiệm kinh tế nhất nhưng kết quả lại phập phù nhất (vs ribotype, RFLP, AFLP, PFGE or MLST). Nếu cậu có bí quyết gì để giải quyết cái sự phập phù đó thì hôm nào rảnh chia sẻ cho anh em xem với nhé.

Trung mến, rất cám ơn vì những chia sẻ của bạn. Thực ra cái công đoạn screening và phâ tích polymorhism và các population genetics analysis của project này xong từ trước và do người khác làm, đề tài của mình là mảng khác. Giờ xong hết PhD rồi ở lại làm thuê cho ông thầy, ông bảo làm gì mình làm đó cho qua ngày í mà.
Nhiệm vụ được giao của mình là sequencing các band của RAPD, các DNA từ các band này đã có sẵn, miễn sao có được nucleotide sequence của chúng là hết nhiệm vụ. Subcloning 1 vài mẫu thì ok nhưng hàng nghìn mẫu thì hơi ngại, đang tìm cách nào để lười được í mà. Có lẽ suncloning là cách duy nhất nhỉ?.
Trung làm bên CNSH của DHQG hả? trước mình hay qua chỗ cô Châu hóa sinh, hồi đó còn làm bên sư phạm mà, đi lâu lắm rồi chắc ở đó thay đổi nhiều lắm. À nghe nói giờ bên đó có Viện Vi sinh học to lắm đúng không? À có họ hàng với thầy Trịnh Tam Kiệt không đấy? hhahahahaha

 

[quang]

Xin hỏi quang 1 vấn đề, Bạn đang làm về QTLs à? Mình đang tìm hiểu về vấn đề này, có gì chỉ bảo thêm nhé.
Còn về vấn đề của bạn, Chỉ nghĩ đến việc dùng sản phẩm của RAPD để direct sequencing là thấy mệt rồi. Tính khả thi, mình nghĩ sẽ không cao đâu.
Mục đích của bạn là tìm ra trình tự của cảc Transposon. Vậy hãy liên hệ với nghiên cứu này xem sao. (sử dụng kỹ thuật AFLP)http://www.sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Pages1&go=page&pid=4

P/S: bạn giới thiệu cho mình cách sử dụng phần mềm MAPMAKER/EXP và MAPMAKER/QTL nhé. Có Software thì share luôn nhé.
Thân chào.

Cám ơn Hải đã quan tâm, ừ mấy cái linh tinh này mình làm thuê cho ông thầy í mà. Chỉ được giao nhiệm vụ sequencing thôi còn các phân tích trình tự mình không làm. Không mình không làm QTL mapping, trước tới giờ chỉ làm molecular evolution, đang học mấy cái phân tích quantitative traits vào mục đích nghiên cứu tiến hóa, lĩnh vực evolutionary quantitative genetics í mà. Nếu cũng quan tâm cùng nhau chia sẻ nha.

 

[Trịnh Thành Trung]

Ối jời, những hàng ngàn mẫu cơ à? mệt đấy nhỉ, good luck...

À có họ hàng với thầy Trịnh Tam Kiệt không đấy? hhahahahaha

Ừ, có họ cùng với thầy nhưng khác chi, thầy là Trịnh Tam còn tớ là Trịnh Thành. Trịnh Thành tiến hóa từ hướng Ninh Bình ra còn Trịnh Tam thì tớ chịu. Thế nên chỉ có quan hệ "họ" thôi chứ không có "hàng" hihi...

 

[Cao Xuân Hiếu]

Nhiệm vụ được giao của mình là sequencing các band của RAPD, các DNA từ các band này đã có sẵn, miễn sao có được nucleotide sequence của chúng là hết nhiệm vụ. Subcloning 1 vài mẫu thì ok nhưng hàng nghìn mẫu thì hơi ngại, đang tìm cách nào để lười được í mà. Có lẽ suncloning là cách duy nhất nhỉ?.

Nếu ở đó (hoặc xung quanh đó) có con 454 sequencing thì có thể ko cần subclone.