quang
Senior Member
Lại phải tìm hiểu con 454 này rồi, tiếc gì mà không cho mấy lời chi tiết hơn nhỉ?
Làm thế nào để sequencing sản phẩm RAPD tốn ít công nhất?
- Thread starter quang
- Start date
Lại phải tìm hiểu con 454 này rồi, tiếc gì mà không cho mấy lời chi tiết hơn nhỉ?
Nguyễn Phước Hùng
Senior Member
Cái đó chắc là một dạng hệ thống sequencing, lần này mới biết có cái đó, anh Hiếu chắc sài rồi nên giải thích thêm cho anh em đi!
http://www.liv.ac.uk/agf/454sequencing.html
http://www.liv.ac.uk/agf/454sequencing.html
quang
Senior Member
Bác Lương, chú Hùng và các đồng chí mến: Vừa đọc cái con 454, hình như ưu điểm của nó là sequencing được fragment cực dài. Có cảm giác cần phải nêu lại vấn đề đang đặt ra, sorry mọi người vì tôi đã không làm rõ câu hỏi nên dễ gây hiểu lầm:
Hiện tôi không thể nghĩ ra cách nào để sequencing hàng ngàn band của RAPD một cách ít tốn công sức nhất. Không thể dùng direct sequencing (tức dùng chính primer đã được dùng để tạo ra band đó vào sequencing reaction nhằm đọc trực tiếp band đó) để đọc trình tự của band được vì cái primer của thằng RAPD nó bắt cặp cả vào 2 đầu của template DNA trong sequencing reaction (khi chạy RAPD chỉ cần 1 primer, primer này sẽ bắt cặp vào 2 đầu và nhân đoạn ngẫu nhiên lên) >>> loại direct sequencing. Cách khác nghĩ đến là subcloning tức cho DNA trong band của RAPD vào vector, lợi dụng trình tự đã biết của vector mà thiết kế cặp primer chạy từ vùng flanking của đoạn insert và chạy sequencing reaction sẽ thu được sequencu của band RAPD cần biết. Cách này là routine trong lab tôi nhưng vì tôi lười nên mong tìm ra cách nào tốn ít công hơn. Vấn đề không phải là band của RAPD có kích thước dài hay ngắn mà gây khó dễ trong sequencing mà là vì số lượng mẫu cần sequencing nhiều quá. Sorry đã gây ra hiểu lầm.
tôi mượng tượng công việc của bạn giống như 1 cái meta-genomic sequencing. Nếu đúng như vậy thì 454 có thể là sự lựa chọn tốt. Nó ko chỉ cho phép đọc đoạn dài ko cần subclone (short gun) mà còn đọc trong 1 đống hỗn độn các template trong 1 dung dịch. Không biết tôi hiểu như vậy có chệch với công việc của bạn k?
quang
Senior Member
Chào anh Hiếu, cám ơn anh đã chia sẻ nhiều hơn.
Các mẫu của tôi là các trình tự DNA không quá dài (thường dưới 2 kb) và cũng không hỗn độn (các band đã được tách riêng rẽ, mẫu nào ra mảnh ý), nhưng vấn đề nằm ở chỗ là trình tự nucleotide ở 2 đầu của đoạn DNA cần đọc chưa biết >>> không thể thiết kế primer cho sequencing reaction được. Sẽ có câu hỏi: Chưa biết trình tự 2 đầu của đoạn DNA đó thì làm sao có thể nhân đoạn đó lên trong PCR đầu tiên được? Trả lời: Đoạn DNA đó được nhân lên nhờ 1 chiếc primer theo kiểu RAPD. Sao không dùng chính cái primer đó vào sequencing reaction mà đọc? Trả lời: cái primer đó sẽ bắt cặp vào cả 2 đầu của đoạn DNA cần đọc >>> sequencing reaction không thể xảy ra >>> không được. Tóm lại: vấn đề nằm ở chỗ vì không biết trình tự của 1 trong 2 đầu của đoạn DNA cần đọc nên không có primer hiệu quả để cho sequencing reaction xảy ra, cho nên phải dùng subcloning. Có cách nào khác đỡ tốn công sức hơn subcloning hay không ạ?
Did I make myself understood? Mong nhận được nhiều góp ý của các bạn.
Có vẻ bạn không outsmart được ông thầy của mình rồi
. Ông ấy bắt bạn bioculi cho mình (subcloning), mà bạn đòi có cách chẳng cần động tay động chân nhiều lắm cũng cho kết quả. Gợi ý duy nhất là outsource cái phần subcloning cho bọn bioculi ở VN còn mình làm sequencing thôi.
. Ông ấy bắt bạn bioculi cho mình (subcloning), mà bạn đòi có cách chẳng cần động tay động chân nhiều lắm cũng cho kết quả. Gợi ý duy nhất là outsource cái phần subcloning cho bọn bioculi ở VN còn mình làm sequencing thôi.
quang
Senior Member
Có vẻ bạn không outsmart được ông thầy của mình rồi
Cực thích thuật ngữ bioculi của bác Lương. Một lwof khuyên chí lí, vẫn đang tìm cách lười mà không phải chia tiền cho ai, chết tại tham.
Ý tưởng của tôi là dựa vào nguyên lý 454/pyrosequencing để cắt nhỏ sequence này ngẫu nhiên và thật yếu bằng DNA shearing sau đó 1 DNA band /sequence của bạn sẽ trở thành hỗn độn với các mảnh DNA với kích thước khác nhau nhưng sẽ overlap lên nhau. Điểm mạnh của việc dùng 454 là sẽ có thể đọc được "đồng thời" (song song) các đoạn này và nối sequence nhỏ lại thành 1 đoạn hoàn chỉnh. Các sequencer dựa trên nguyên lý khác sẽ phải mất thời gian tách nhỏ các đoạn khác nhau mà cách duy nhất hiệu quả là subclone.
Bạn nên trao đổi trực tiếp với nhóm 454 của Roche nơi bạn làm việc. Nó sẽ cố vấn cho bạn là ý tưởng đó có khả thi hay k. Và nếu lab của bạn có danh tiếng nhiều khả năng Roche sẽ sequence miễn phí cho bạn để demo ứng dụng mới của 454.
Nếu ko có khả năng tiếp cận 454 thì thử xem pyrosequencing có giúp bạn được k?
