Cách tăng mức độ biểu hiện protein người ở E.coli

[Nguyễn Trung Thành]

chào các anh chị!
Em gặp khó khăn về biểu hiện một protein (có nguồn gốc từ người) trên E.coli. hiện tại em đang dùng hệ thống pET thử với 3 loại tag: His-tag, GST-tag + His-tag, Trx + his-tag trên BL21 (DE3), vấn đề mà em gặp phải là:
1- fusion protein của em biểu hiện rất kém - Vấn đề này em không biết nên xử lý thế nào
2- Tan rất ít - em đã thay đổi các điều kiện nuôi cấy (IPTG =0.5-1mM, OD600 = 0.5-1.0, nhiệt đô thay đổi 37 -18-10), nhưng duy nhất em chỉ nhận được kết quả protein với TrX + His-tag ở 10 độ là tan khoảng 50% và biểu hiện rất kém (không đủ để mất mát sau mỗi bước tinh sạch), còn lại là không tan + biểu hiện kém hoặc không biểu hiện
3- Khó tinh sạch với Ni-NTA, có một band tạp khoảng 50KD dậm và to hơn band target protein nhiều lần (target protein = 89kD), bản thân target protein bám vào NTA cũng yếu (trong dịch bị rửa trôi phát hiện band khá rõ) - Em đã thử thay đổi các điều kiện cơ bản như thêm triton-X100 (0.5%), 2-Metabecaptanol (1.4mM), glycerol (10%) hoặc thêm đồng thời tất cả, washing bufer xài tới 2M NaCl (vì em xài FPLC nên em nghĩ ko cần thay đổi nồng độ Imidazone: binding buffer: 500mM NaCl, 25mM Tris 8.0, 20mM Imidazone; Elution buffer: chỉ khác là 1M Imidazone, washing buffer chỉ khác 1-2M NaCl) protein bám yếu nên em không thử DTT và Ethanol vì em nghĩ 2 chất nỳ sẽ là khả năng bám yếu hơn em không dùng.
- Hiện tại em đang co ý định co-expression với 1- chaperon, 2- Rare codon, 3-Protein mục tiêu của nó (protein của em thuộc loại protease) với hy vọng cải thiện khả năng tan - mọi người nghĩ như vậy liệu có ổn không
---> các anh chị ai có kinh nghiệm về sử lý các khó khăn này (đặc biệt là tăng biểu hiện) hoặc vấn đề liên quan xin cho em lời khuyên
Xin cảm ơn mọi người

P/S

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

chào các anh chị!
Em gặp khó khăn về biểu hiện một protein (có nguồn gốc từ người) trên E.coli. hiện tại em đang dùng hệ thống pET thử với 3 loại tag: His-tag, GST-tag + His-tag, Trx + his-tag trên BL21 (DE3), vấn đề mà em gặp phải là:
1- fusion protein của em biểu hiện rất kém - Vấn đề này em không biết nên xử lý thế nào
2- Tan rất ít - em đã thay đổi các điều kiện nuôi cấy (IPTG =0.5-1mM, OD600 = 0.5-1.0, nhiệt đô thay đổi 37 -18-10), nhưng duy nhất em chỉ nhận được kết quả protein với TrX + His-tag ở 10 độ là tan khoảng 50% và biểu hiện rất kém (không đủ để mất mát sau mỗi bước tinh sạch), còn lại là không tan + biểu hiện kém hoặc không biểu hiện
3- Khó tinh sạch với Ni-NTA, có một band tạp khoảng 50KD dậm và to hơn band target protein nhiều lần (target protein = 89kD), bản thân target protein bám vào NTA cũng yếu (trong dịch bị rửa trôi phát hiện band khá rõ) - Em đã thử thay đổi các điều kiện cơ bản như thêm triton-X100 (0.5%), 2-Metabecaptanol (1.4mM), glycerol (10%) hoặc thêm đồng thời tất cả, washing bufer xài tới 2M NaCl (vì em xài FPLC nên em nghĩ ko cần thay đổi nồng độ Imidazone: binding buffer: 500mM NaCl, 25mM Tris 8.0, 20mM Imidazone; Elution buffer: chỉ khác là 1M Imidazone, washing buffer chỉ khác 1-2M NaCl) protein bám yếu nên em không thử DTT và Ethanol vì em nghĩ 2 chất nỳ sẽ là khả năng bám yếu hơn em không dùng.
- Hiện tại em đang co ý định co-expression với 1- chaperon, 2- Rare codon, 3-Protein mục tiêu của nó (protein của em thuộc loại protease) với hy vọng cải thiện khả năng tan - mọi người nghĩ như vậy liệu có ổn không
---> các anh chị ai có kinh nghiệm về sử lý các khó khăn này (đặc biệt là tăng biểu hiện) hoặc vấn đề liên quan xin cho em lời khuyên
Xin cảm ơn mọi người

P/S

Lâu lắm không làm mấy vấn đề trên nên chỉ có vài thiển ý lung tung mong bạn đừng chê cười nhé

1. Đầu tiên check publications xem có nhóm nào express thành công cùng loại protein này hoặc các protein liên quan chưa. Nếu có rồi thì cứ theo đó mà làm, nếu chưa có tính tiếp.

2. Thử dùng vector khác/chủng E. coli khác xem sao trước khi fusion với chaperon hay codon optimization...

3. Bạn sắp thành chuyên gia tinh sạch protein bằng Ni-NTA rồi. Với vấn đề trên thì trước hết cần kiểm tra bands nhìn thấy có đúng là protein bạn express không. Làm western blot sử dụng His-Tag protein với mẫu là total cell lysate, dịch rửa, purified products.

Nhưng nói chung là hơi ngạc nhiên khi bạn chưa giải quyết xong vấn đề biểu hiện kém/độ tan kém đã đi tinh sạch. Chưa giải quyết xong vấn đề tinh sạch lại đã nghĩ tới chaperon, codon... Cần bám vào mục tiêu của mình rồi làm chắc từng bước đã nhé.

 

[Nguyễn Trung Thành]

1. biểu hiện protein này thì chưa có, còn biểu hiện các protein cùng họ thì đã có rất nhiều nhóm làm thành công, tuy nhiên ngay chính trong lab em cũng có nhiều người làm với các protein cùng họ, trên cùng hệ thống mà em đang dùng, cũng có những protein biểu hiện khá (nói là tốt thực ra so với các protein nguồn gốc vi khuẩn thì kém rất xa) cũng có những protein không biểu hiện (trường hợp này thường họ sẽ bỏ đi không làm mà thử với một protein khác). Em thì không muốn bỏ vì bắt đầu với một protein khác chắc gì đã tốt hơn
2. nguyên nhân mà em dự định dùng chaperon và codon optimization là vì em nghĩ nếu biểu hiện ít nhưng tan nhiều sẽ khắc phục được phần nào về lượng protein cần thiết + tinh sạch từ một lượng lớn pellet có thể sẽ đạt đủ lượng protein em cần

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

1. biểu hiện protein này thì chưa có, còn biểu hiện các protein cùng họ thì đã có rất nhiều nhóm làm thành công, tuy nhiên ngay chính trong lab em cũng có nhiều người làm với các protein cùng họ, trên cùng hệ thống mà em đang dùng, cũng có những protein biểu hiện khá (nói là tốt thực ra so với các protein nguồn gốc vi khuẩn thì kém rất xa) cũng có những protein không biểu hiện (trường hợp này thường họ sẽ bỏ đi không làm mà thử với một protein khác). Em thì không muốn bỏ vì bắt đầu với một protein khác chắc gì đã tốt hơn
2. nguyên nhân mà em dự định dùng chaperon và codon optimization là vì em nghĩ nếu biểu hiện ít nhưng tan nhiều sẽ khắc phục được phần nào về lượng protein cần thiết + tinh sạch từ một lượng lớn pellet có thể sẽ đạt đủ lượng protein em cần

1. Vui nhỉ:

- Thay vì dùng nhiều E. coli strains hoặc vector systems khác nhau để express thành công một loại protein thì lại đổi các loại protein khác nhau để phủ hợp với 1 hệ biểu hiện mà mình có duy nhất!
- Không kiểm tra xem protein mình express ra có đúng là nó không. Cứ điện di thấy băng to băng nhỏ là kết luận.

2. Bạn follow up với định hướng ban đầu như vậy là tốt. Dùng chaperone fusion thì tôi đoán là trong lab bạn đã có sẵn cloned gene nên đơn giản nhưng còn codon optimization thì bạn có biết phải làm thế nào không? Không nên bỏ dễ tìm khó, chạy qua mấy lab xin alternative vectors and E. coli strains về sau đó clone gene của bạn vào rồi express xem sao đã.

3. Lab bạn vui nhỉ, chuyên nhắm đến proteases à, nhưng hơi shock khi nghe bạn kể về các anh chị trong lab.

Goodluck

 

[Nguyễn Trung Thành]

- Thật ra, chaperon, Rare codon trong lab em đều đã có sẵn, subtrate protein em cũng đã tinh sạch hoàn toàn nên mới định phát triển theo hướng này
- chạy western thì đương nhiên sẽ phải làm, chỉ tại em nghĩ là nên tiến hành sau khi đã optimize được quá trình biểu hiện và tinh sạch
- Em mới bắt đầu công việc nghiên cứu và làm việc ở đây gần 2 tháng, nên vẫn chưa quen lắm và cũng chưa nắm được nhiều phương pháp làm việc, chưa hiểu biết công việc của các lab khác, còn rất nhiều ngỡ nên đôi lúc chả biết mình phải liên hệ xin xỏ thế nào, cho nên mới "cái gì có sẵn thì làm trước"
anyway, Thank anh Hưng nhiều

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Lab này mạnh quá, bỏ protein này làm protein khác là đổi đề tài rồi. Hoặc giả lab được cấp 1 cục tiền, muốn làm gì thì làm