Thạch Thành Trung
Senior Member
Em đang quan tâm đến hệ thống vector Topo pCR2.1 nhưng những thông tin về nó còn khá hạn chế. Không biết tiền bối nào có tài liệu hay đã thao tác qua nó rồi thì chỉ bảo giúp em với.
Vector Dùng Trong Tạo Dòng
- Thread starter Thạch Thành Trung
- Start date
Ặc, bạn đã tìm thông tin ở những đâu và có những thông tin gì rồi mà nói là còn hạn chế?
Giáo viên hướng dẫn khi đưa cho bạn đề tài làm với vector này có nói cho bạn biết vector này của hãng nào sản xuất, có đưa kèm catalog không?
Thạch Thành Trung
Senior Member
Đây là một trong những hướng nghiên cứu của lab, và em phải viết một đề cương chi tiết để báo cáo lại với giáo viên hướng dẫn để xem khả năng thực hiện được đến đâu. Hiện tại giáo viên hướng dẫn không ở gần vả lại đây không phải là một đề tài tốt nghiệp nên tất cả từ A-Z em phải làm, giáo viên hướng dẫn chỉ cố vấn những điểm nào vướng mắc mà thôi.
Tài liệu thì em tự search và dựa vào một số đề tài của anh chị. Rất tiếc là post hoài mà không được, để hôm sau upload cho pakon tham khảo vậy
Tài liệu thì em tự search và dựa vào một số đề tài của anh chị. Rất tiếc là post hoài mà không được, để hôm sau upload cho pakon tham khảo vậy
Nguyễn Đình Cường
Junior Member
Đây là một trong những hướng nghiên cứu của lab, và em phải viết một đề cương chi tiết để báo cáo lại với giáo viên hướng dẫn để xem khả năng thực hiện được đến đâu. Hiện tại giáo viên hướng dẫn không ở gần vả lại đây không phải là một đề tài tốt nghiệp nên tất cả từ A-Z em phải làm, giáo viên hướng dẫn chỉ cố vấn những điểm nào vướng mắc mà thôi.
Tài liệu thì em tự search và dựa vào một số đề tài của anh chị. Rất tiếc là post hoài mà không được, để hôm sau upload cho pakon tham khảo vậy
"Đây là một trong những hướng nghiên cứu của lab": nghe to tát quá nhỉ???
Em đọc manual về TOPO TA cloning này chưa? http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf
Thạch Thành Trung
Senior Member
To tát gì đâu anh ơi, em chỉ phụ trách một mảng của đề tài này thui.
Thanks anh Cường về tài liệu trên, em đã đọc qua trước đây rồi, hi vọng được anh và mọi người cung cấp thêm một số tài liệu khác
Đây là một trong những tài liệu giới thiệu về tính ưu việt của Topo vector so với những vector tạo dòng thông thường khác:
[media]www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/710-021164-CustomTOPOBrochure.pdf[/media]
Thanks anh Cường về tài liệu trên, em đã đọc qua trước đây rồi, hi vọng được anh và mọi người cung cấp thêm một số tài liệu khác
Đây là một trong những tài liệu giới thiệu về tính ưu việt của Topo vector so với những vector tạo dòng thông thường khác:
[media]www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/710-021164-CustomTOPOBrochure.pdf[/media]
http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1295
1 topic liên quan, Trung xem có giúp ích gì không nhé.
1 topic liên quan, Trung xem có giúp ích gì không nhé.
To tát gì đâu anh ơi, em chỉ phụ trách một mảng của đề tài này thui.
Thanks anh Cường về tài liệu trên, em đã đọc qua trước đây rồi, hi vọng được anh và mọi người cung cấp thêm một số tài liệu khác
Đây là một trong những tài liệu giới thiệu về tính ưu việt của Topo vector so với những vector tạo dòng thông thường khác:
www.invitrogen.com/content/sfs/brochures/710-021164-CustomTOPOBrochure.pdf
Đề tài của bạn là dùng vector TOPO để tách dòng hay tạo vector TOPO?
Thạch Thành Trung
Senior Member
Đề tài của bạn là dùng vector TOPO để tách dòng hay tạo vector TOPO?
Hi, em không dám cạnh tranh với hai "đại gia" Fermentas và invitrogen đâu, nên đề tài của em chỉ là sử dụng Topo để tạo dòng thôi chứ không thiết kế tạo Topo
Hi, em không dám cạnh tranh với hai "đại gia" Fermentas và invitrogen đâu, nên đề tài của em chỉ là sử dụng Topo để tạo dòng thôi chứ không thiết kế tạo Topo
Lê Vũ Hồng Hải
Senior Member
em cũng đang làm về tạo dòng. Việc ligase giữa sp PCR và vector tốt nhất là khi nào.?
khi sp PCR vừa mới chạy ra hay sp PCR đã để lâu.
việc sử dụng sp PCR đã cũ có anh hưởng lớn gì đến kết quả của clone không?
có nên sử dụng sp PCR cũ không. (trong tình huống của em là không có thể tạo ra sản phẩm pcr mới được.)
khi sp PCR vừa mới chạy ra hay sp PCR đã để lâu.
việc sử dụng sp PCR đã cũ có anh hưởng lớn gì đến kết quả của clone không?
có nên sử dụng sp PCR cũ không. (trong tình huống của em là không có thể tạo ra sản phẩm pcr mới được.)
Nguyễn Đôn
Senior Member
Bạn nên tinh sạch sản phẩm PCR để tống khứ hết các loại enzyme, dNTP còn lẫn trong sản phẩm mà có thể gây cản trở đến các phản ứng sau.
Sau đó tùy theo phương pháp tạo dòng mà bạn phải làm thêm một số bước (như tạo đầu dính bằng enzyme cắt giới hạn, v.v...).
Tôi nghĩ là không có vấn đề gì trong phản ứng nối cho sản phẩm PCR để lâu. DNA khá bền, nếu bạn trữ lạnh thì cũng không bị "hư hỏng" nhiều. Chỉ trừ khi bạn quăng nó vô góc lab rồi sực nhớ lôi ra làm thì mới hỏng
Trong trường hợp không thể tạo sản phẩm PCR mới như của bạn (hết mẫu?) thì cứ thử làm xem nó thế nào. Chúc bạn có kết quả tốt!
1. Tham khảo các ý Đôn đã viết.
2. Cần đưa thêm dữ kiện về trường hợp của bạn, càng cụ thể càng tốt thì mới có thể giải đáp được.
3. BONUS: nếu bạn dùng vector TA để tách dòng trực tiếp, dùng sản phẩm PCR thì sản phẩm PCR để lâu sẽ mang lại phản ứng ligation kém hiệu quả hơn.
4.
Tình huống quái nhỉ, chẳng lẽ PCR 1 lần ra kết quả nhưng không lặp lại được? Nếu đúng, có thể dùng chính sản phẩm PCR cũ đó làm template.
Lê Vũ Hồng Hải
Senior Member
Cảm ơn hai anh đã cho em ý kiến gia tăng lòng tin của em.
Trong trường hợp của em : sản phẩm pcr của em sẽ được tinh sạch theo kit của Qiagen sau đó em dùng vector pGEM- T easy để gắn kết vào. Hình như vecto này kết theo kiểu T-A. Dòng ecoli sử dụng là DH5- alpha
Các sản phẩm PCR được trữ ở -20 oC, sản phẩm tạo được tạo ra cách đây khoảng 1-2 tháng.
Em không thề Pcr các sản phẩm mới vì hết mẫu (lách heo)
Kit ly trích RNA promega không ổn định(lúc ly trích được, lúc không). khi ly trích thường bị kẹt ngay cột không ly tâm xuống được dù đã rất cẩn thận trong việc hút, không biết tại sao chúng kẹt hoài, phải đổ ra, sau đó chạy PCR thì không có sp. anh chị nào có protocol, kinh nghiệm ly trích theo kiểu này giúp em với. email em là apollo0272000@gmail.com
Trong trường hợp của em : sản phẩm pcr của em sẽ được tinh sạch theo kit của Qiagen sau đó em dùng vector pGEM- T easy để gắn kết vào. Hình như vecto này kết theo kiểu T-A. Dòng ecoli sử dụng là DH5- alpha
Các sản phẩm PCR được trữ ở -20 oC, sản phẩm tạo được tạo ra cách đây khoảng 1-2 tháng.
Em không thề Pcr các sản phẩm mới vì hết mẫu (lách heo)
Kit ly trích RNA promega không ổn định(lúc ly trích được, lúc không). khi ly trích thường bị kẹt ngay cột không ly tâm xuống được dù đã rất cẩn thận trong việc hút, không biết tại sao chúng kẹt hoài, phải đổ ra, sau đó chạy PCR thì không có sp. anh chị nào có protocol, kinh nghiệm ly trích theo kiểu này giúp em với. email em là apollo0272000@gmail.com
Nguyễn Đôn
Senior Member
Như vậy tóm lại là lần trước bạn đã làm phản ứng nối với vector pGEM T-easy? Chắc là không thành công nên lần này bạn mới muốn làm lại?
Sản phẩm PCR trữ ở âm 20 độ C thì không có việc gì xảy ra. Nếu bạn đã hết mẫu cDNA thì lấy PCR cũ làm khuôn mẫu để chạy PCR mới. Sau đó tiến hành gắn đầu A để làm phản ứng nối T-A như bình thường.
Heo của bạn có gì đặc biệt không? Ra chợ mua lách về chắc cũng xài được
Kit cua Promega thì thường là chạy tốt đó.
Tôi chưa làm với mẫu mô động vật lần nào nên không rành lắm, nhưng có thể kẹt cột là tại vì mẫu mô của mình còn chưa được tán nhuyễn hoàn toàn. Bạn thử băm vằm chúng nó kỹ lưỡng hơn một chút xem sao.
Nguyễn Đình Quát
Junior Member
Em hãy post lên cái tiến trình em phá vỡ lách (dụng cụ gì ?) và homogenize bằng buffer gì ? và em thu lysate bằng cách nào ? trước khi em cho qua cột spin column để mọi người xem và góp ý cho em. Chứ theo anh thì anh đồng ý với ý kiến của Nguyễn Đôn là kit của Promega la tương đối tốt rồi, với lại bước spin down qua column này tương đối dễ dàng, nên hầu như tất cả các Kit của các công ty thương mại đều không có vấn đề.
Thân
Nguyễn Đình Quát
Junior Member
Lưu ý với em là : qua tất cả các bước em đều phải stock nó.
1. Lách heo đem về : trữ ở -70oC, vài tháng không thành vấn đề
2.Thu lysate của lách : trữ ở -70oC, vài tháng cũng không thành vấn đề
3. RNA tinh sạch : trữ ở -20oC hoặc -70oC, vài tháng đến 1 năm sự degrade không đáng kể
4. cDNA (tổng hợp đúng theo protocol của những công ty lớn như Invitrogen ...) và PCR products : trữ ở -20oC hoặc -70oC, vài tháng cũng không thành vấn đề, ngoại trừ em đã thaw --> freeze vài lần trong qua trình làm phản ứng
5. Ligate gene vào T-easy : sau khi chọn KL trắng --> kiểm tra lại xem đoạn gene đã được insert thành công chưa (bằng nhiều phương pháp) --> LB broth --> thêm vào glycerol theo tỉ lệ 15% hoặc 50% tùy theo chủng E.coli em sử dụng --> rồi trữ ở -70oC vài năm không thành vấn đề. Khi cần, chỉ lấy E.coli ra, thaw rồi cấy lại là thu hoạch được
@ Chỉ lo là trong quá trình trữ, điện cúp là không thể tiên đoán được mức độ ảnh hưởng. Mà ở nhà điện cúp thường xuyên thì khó nói lắm.
Thân
