Làm sao tách DNA plasmid ra khỏi DNA genome?

[Luyện Quốc Hải]

Xin mời các bạn tham gia trả lời câu hỏi này.
? ? Làm sao tách DNA plasmid ra khỏi DNA genome? (của bạn Hoàng Anh Hoàng) (hay nói cách khác: Nguyên lý tách chiết DNA plasmid ra khỏi DNA Genome).
? ? Đây là một kỹ thuật mà nhiều người vẫn hàng ngay tiến hành tách chiết DNA plasmid. Tuy nhiên, Tôi mong muốn mọi người hãy tích cực trả lời một cách triệt để vấn đề này. Sau đó, nhưng câu trả lời này sẽ là một tư liệu rất quý cho việc tra cứu sau này.
? ? Thân.

 

[Vương Gia Tuệ]

Theo toi co các phương pháp sau đây:
(1) Biến tính kiềm: tức là dùng môi trường kiềm (pH 12 - 13) để biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó phục hồi lại pH 7.0 để khôi phục cấu hình của DNA. Do DNA plasmid cấu trúc gọn hơn nên phục hồi nhanh hơn. Sau đó tiến hành ly tâm, thu dịch nổi. DNA plasmid sẽ nằm ở dịch nổi, DNA genome sẽ nằm ở phần cặn.
(2) Phân đoạn DNA bằng ly tâm trong gradient nồng độ CsCl có mặt ethidiumbromide: sẽ thu được DNA plasmid dạng supercoiled do nó ít chèn EtBr nhất, còn dạng DNA thẳng và xoắn sẽ bị chèn nhiều EtBr nên tỉ trọng chúng sẽ khác nhau.
Có thể tăng số bản sao của plasmid và ức chế số bản sao của DNA genome bằng kháng sinh (chloraphenicol). Như vậy, việc thu nhận plasmid sẽ dễ dàng hơn.

 

[Luyện Quốc Hải]

Hiện tại, có 3 phương pháp chính thường được dùng để tách DNA plasmid ra khỏi vi khuẩn (thường là E. coli):
- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm
- Phương pháp đun sôi
- Phương pháp dùng Lithium
    Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Trong thực nghiệm thì cả 3 phương pháp trên đều cho hàm lượng và chất lượng DNA tốt, đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
   Cả 3 phương pháp đều liên quan đến việc thu nhận DNA plasmid  mạch vòng từ hỗn hợp lẫn tạp với DNA genome mạch thẳng.
   Việc xử lý hoặc là bằng base hay bằng chất tẩy đều với mục đích là phá huỷ mối liên kết giữa các cặp base (của DNA) làm cho DNA genome mặch thẳng bị biến tính và dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, vì DNA plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.
 
   Cụ thể:
- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm (alkaline lysis): Vi khuẩn bị dung giải (lysis) khi xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) and NaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein – phá vỡ màng tế bào (tham khảo topic "vai trò của các detergent trong quá trình tách chiết DNA), và NaOH (nằm trong Sol II) sẽ làm biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium acetate (CH3COOK) (nằm trong Sol III). Khi dung dịch đã được dung hoà thì DNA plasmid vòng sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan vào trong dung dịch. Ngược lại, DNA genome và các protein khác bị kết tủa và “vướng” vào trong phức hợp SDS-kali, sau đó được loại bỏ bằng ly tâm.
Chú ý: Phản ứng cắt enzyme sẽ không tốt khi DNA bị lẫn NaOH/SDS hay là kali acetate, do đó cần phải rửa tủa cẩn thận bằng cồn 70%.


- Phương pháp đun sôi (boiling): Vi khuẩn có chứa DNA plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 (một chất tẩy phi ion – nonionic detergent) và nhiệt độ. DNA genome sẽ vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn và được loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, DNA plasmid được giải phóng và hoà tan vào trong dung dịch và được thu nhận bằng cách tủa với alcohol.
Chú ý: Phương pháp này nhanh nhưng chất lượng DNA thấp hơn so với phương pháp thuỷ phân bằng kiềm.


- Phương pháp dựa vào Lithium: khi xử lý với hỗn hợp Triton X-100/LiCl thì chỉ có màng trong (inner plasma membrane) của tế bào vi khuẩn sẽ bị phân huỷ. Do đó, ở phương pháp này vẫn giữ được hình dạng của tế bào (vì màng ngoài không bị phá huỷ), và tất nhiên là DNA plasmid vẫn còn bị giữ lại trong tế bào. Nhưng sau khi bổ sung phenol/chloroform vào làm biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời tế bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (bao gồm cả DNA plasmid) ra ngoài, trong khi đó thì DNA genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào và được loại bỏ bằng ly tâm.

Bonus: Bảo quản DNA plasmid
  Bảo quản Plasmid trong tế bào:
Plasmid có thể được bảo quản thời gian ngắn (khoảng 1 tháng) khi tồn tại trong tế bào vi khuẩn và được cất ở 40C.
   Nếu muốn bảo quản tế bào chứa plasmid lâu hơn thì nên bổ sung 1V glycerol hoặc DMSO và đông lạnh ở -70[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C.  
    Bảo quản DNA plasmid:
- DNA plasmid có thể được bảo quản trong đệm TE ở 4[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C trong một vài tuần. Nếu ở  -20[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C thì được vài năm.


Tài liệu tham khảo: “Current protocols in molecular Biology” 2003. Jonh Wiley & Sons

 

[Luyện Quốc Hải]

Chào các bạn
?Vì bạn Tuệ có nhắc đến phương pháp tách plasmid sử dụng CsCl/EtBr nên Tôi xin trao đổi một số thông tin sau:
? ? Phương pháp tách plasmid sử dụng CsCl/EtBr cho độ tinh sạch rất cao, tuy nhiên phương pháp này lại sử dụng EtBr (là một tác nhân gây đột biến) và thường đòi hỏi thời gian siêu ly tâm rất lâu nhằm mục đích thiết lập gradient (14h ở 65,000 rpm, VTi80 rotor).
?Nguyên lý cơ bản: vì EtBr là một mutagen có khả năng gắn xen vào mạch đôi DNA làm tăng tỉ trọng của DNA. Tuy nhiên, EtBr lại khó gắn xen vào trong DNA plasmid hơn là vào DNA genome. Điểm quan trọng gây ra sự khác biệt lớn đó là do DNA plasmid có cấu trúc vòng và thường ở dạng supercoiled. Hay nói cách khác: DNA plasmid nhẹ hơn và hình thành băng ở vùng có mật độ cao CsCl hơn DNA genome khi ta siêu ly tâm.
? ? Cuối cùng, EtBr có thể được loại bỏ bằng cách cho DNA plasmid đi qua cột sắc ký trao đổi ion (cation exchange column) và CsCl được loại bỏ bằng ethanol.

? Ngoài ra còn một số phương pháp khác, mong các bạn tham khảo và trao đổi thêm.
Thân

 

[Vương Gia Tuệ]

Cám ơn những đóng góp của a Hải. Thú thật em không chuyên về công nghệ gene nên kiến thức chưa vững lắm. Mong được học hỏi thêm từ a

 

[Hạng Thiếu Long]

cảm ơn mn. thông tin rất bổ ích