Hiện tại, có 3 phương pháp chính thường được dùng để tách DNA plasmid ra khỏi vi khuẩn (thường là E. coli):
- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm
- Phương pháp đun sôi
- Phương pháp dùng Lithium
Việc chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào điều kiện thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Trong thực nghiệm thì cả 3 phương pháp trên đều cho hàm lượng và chất lượng DNA tốt, đảm bảo cho các thí nghiệm tiếp theo.
Cả 3 phương pháp đều liên quan đến việc thu nhận DNA plasmid mạch vòng từ hỗn hợp lẫn tạp với DNA genome mạch thẳng.
Việc xử lý hoặc là bằng base hay bằng chất tẩy đều với mục đích là phá huỷ mối liên kết giữa các cặp base (của DNA) làm cho DNA genome mặch thẳng bị biến tính và dễ dàng loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, vì DNA plasmid ở dạng siêu xoắn (supercoiled configuration) có đặc điểm là dễ dàng phục hồi lại hình dạng ban đầu dưới điều kiện hồi tính.
Cụ thể:
- Phương pháp thuỷ phân bằng kiềm (alkaline lysis): Vi khuẩn bị dung giải (lysis) khi xử lý với dung dịch chứa SDS (sodium dodecyl sulfate) and NaOH. Trong đó, SDS sẽ làm biến tính protein – phá vỡ màng tế bào (tham khảo topic "vai trò của các detergent trong quá trình tách chiết DNA), và NaOH (nằm trong Sol II) sẽ làm biến tính DNA genome và DNA plasmid. Sau đó, hỗn hợp được trung hoà bằng potassium acetate (CH3COOK) (nằm trong Sol III). Khi dung dịch đã được dung hoà thì DNA plasmid vòng sẽ được hồi tính nhanh chóng và hoà tan vào trong dung dịch. Ngược lại, DNA genome và các protein khác bị kết tủa và “vướng” vào trong phức hợp SDS-kali, sau đó được loại bỏ bằng ly tâm.
Chú ý: Phản ứng cắt enzyme sẽ không tốt khi DNA bị lẫn NaOH/SDS hay là kali acetate, do đó cần phải rửa tủa cẩn thận bằng cồn 70%.
- Phương pháp đun sôi (boiling): Vi khuẩn có chứa DNA plasmid được phá vỡ bằng lysozyme, Triton-X100 (một chất tẩy phi ion – nonionic detergent) và nhiệt độ. DNA genome sẽ vẫn bám vào màng tế bào vi khuẩn và được loại bỏ bằng ly tâm. Trong khi đó, DNA plasmid được giải phóng và hoà tan vào trong dung dịch và được thu nhận bằng cách tủa với alcohol.
Chú ý: Phương pháp này nhanh nhưng chất lượng DNA thấp hơn so với phương pháp thuỷ phân bằng kiềm.
- Phương pháp dựa vào Lithium: khi xử lý với hỗn hợp Triton X-100/LiCl thì chỉ có màng trong (inner plasma membrane) của tế bào vi khuẩn sẽ bị phân huỷ. Do đó, ở phương pháp này vẫn giữ được hình dạng của tế bào (vì màng ngoài không bị phá huỷ), và tất nhiên là DNA plasmid vẫn còn bị giữ lại trong tế bào. Nhưng sau khi bổ sung phenol/chloroform vào làm biến tính và kết tủa các protein nội bào. Đồng thời tế bào sẽ co lại nhanh chóng và đẩy dung dịch nội bào (bao gồm cả DNA plasmid) ra ngoài, trong khi đó thì DNA genome và protein sẽ bị giữ lại trong sinh khối tế bào và được loại bỏ bằng ly tâm.
Bonus: Bảo quản DNA plasmid
Bảo quản Plasmid trong tế bào:
Plasmid có thể được bảo quản thời gian ngắn (khoảng 1 tháng) khi tồn tại trong tế bào vi khuẩn và được cất ở 40C.
Nếu muốn bảo quản tế bào chứa plasmid lâu hơn thì nên bổ sung 1V glycerol hoặc DMSO và đông lạnh ở -70[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C.
Bảo quản DNA plasmid:
- DNA plasmid có thể được bảo quản trong đệm TE ở 4[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C trong một vài tuần. Nếu ở -20[sup:99f38cc25d]0[/sup:99f38cc25d]C thì được vài năm.
Tài liệu tham khảo: “Current protocols in molecular Biology” 2003. Jonh Wiley & Sons
