Biến nạp vector vào vật chủ là Bacillus

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Thân gửi các anh chị.
Mong anh chị nào đã từng làm biểu hiện trên Bacillus hoặc vi khuẩn Gram+ chia sẻ kinh nghiệm.
Hiện tại em đang thực hiện biểu hiện một gen trên Bacillus, cụ thể là B. megaterium.
Vấn đề em gặp phải ở đây là không thể biến nạp vector vào vật chủ được. Vector sử dụng ở đây là pSpLipA ( http://www.mobitec.com/cms/download/Handbooks/hp-Vector_Expression_Systems-Handbook.pdf )
Trên vector có gen kháng kháng sinh kháng Tetracycline, tuy nhiên dòng B. megaterium lại có thể kháng được kháng sinh này ở mức độ nhẹ, nghĩa là trong môi trường có kháng sinh chúng chỉ phát triển chậm chứ không chết. Chang tế bào chưa biến nạp trên đĩa có kháng sinh ủ thời gian khoảng 24h sẽ có khuẩn lạc mọc lên, sau đó mọc càng ngày càng nhiều. Do đó em không thể chọn lọc tế bào đã mang plasmid và chưa mang plasmid bằng phương pháp sàng lọc kháng sinh.
Để biến nạp trên vi khuẩn gram + là Bacillus em đã thử phương pháp xung điện và protoplast. Để xác định gen đã chèn vào hay chưa thì dùng phương pháp PCR clony. Tuy nhiên đã làm rất nhiều lần rồi nhưng chưa có lần nào PCR lên cả.
Muốn hỏi phải chăng việc PCR để chứng tỏ vi khuẩn đã mang plasmid là không thể vì lượng bản coppy lớn, thành tế bào dày, không tách được plasmid, gặp phải chất ức chế phản ứng PCR?
Rất mong anh, chị, các bạn cho mình ý kiến vì thực sự đã làm rất mệt mỏi mà không có kết quả.
Thân!

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Các bác Nguyễn Xuân Hưng, Nguyễn Ngọc Lương, Cao Xuân Hiếu... Anh chị em sinh học không lẽ chưa ai từng làm với Bacillus hay gram + ạ?
Mong anh/chị nào biết sớm lên tiếng, đề xuất phương pháp biến nạp hiệu quả hơn hoặc chú ý khi biến nạp vào Bacillus.
Hoặc gửi link tài liệu có liên quan.
Em cảm ơn!

 

[cfareast]

Cái này đơn giản thôi em ạ. Anh nhắm mắt cũng biến nạp và biểu hiện ở bacillus. Ngày xưa anh còn biến nạp ligation trực tiếp mà còn lên clone ầm ầm, chứ ko phải plasmid con thoi.
với cái bọn Gram+ này, em phải biến nạp 1 cục vector, rất rất nhiều DNA (gấp 100-1000x đối với E.coli) chứ ko thể biến nạp 1 cái DNA band mảnh được. Ở B.subtilis, sau khi protoplast thì phải để từ 2-4 ngày nó mới mọc.

Tách DNA vecto ở Gram+, cũng như Gram- thôi, chỉ có thêm 1 bước là cho lyzozyme 100 ug/mL, ủ trước 30min. Sau đó tách bình thường.

Hiệu quả cao là biến nạp protoplast, tiếp đó là xung điện.

Về hiệu quả, thì nếu ở E.coli thì có khi 10^9/1ug DNA, còn ở Bacillus, chỉ được 10^5-6 thôi.
Ví dụ vecto cho e.coli, biến nạp xung điện thì chỉ quệt nhẹ cái lên vài tỉ con. Cũng với lượng vecto đó, vào Bacillus, chỉ được 10-20 con thôi...
Bạn phải cẩn thận. Protoplas các bước cũng rắc rối, hỏng 1 cái là làm lại hơi mệt.
good luck

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Về hiệu quả, thì nếu ở E.coli thì có khi 10^9/1ug DNA, còn ở Bacillus, chỉ được 10^5-6 thôi.
Ví dụ vecto cho e.coli, biến nạp xung điện thì chỉ quệt nhẹ cái lên vài tỉ con. Cũng với lượng vecto đó, vào Bacillus, chỉ được 10-20 con thôi...
Bạn phải cẩn thận. Protoplas các bước cũng rắc rối, hỏng 1 cái là làm lại hơi mệt.
good luck

Cảm ơn anh Cfareast đã giúp đỡ.
Theo một bài báo em đọc (file đính kèm) thì hiệu suất cao nhất người ta đạt được chỉ khoảng 10^3 CFU/ug DNA, vậy mà theo anh là 10^5-6 CFU/ug. Anh có thể gửi em protocol đã từng làm qua đây hoặc email: tuyetnhung0608@gmail.com được không?
Khi anh làm xung điện thì lượng plasmid cho vào "một cục rất lớn" là bao nhiêu ug? Mật độ bao nhiêu ng/ul là thích hợp? Plasmid có cần loại hết RNA không, và có cần thiết cắt thôi gel để tinh sạch?
Đối với phương pháp protoplast, có thể sử dụng màng lọc 2um để lọc thu tế bào trần được không? Quan sát protoplast trên kính hiển vi có phải tế bào Baccillus khi mất cell wall thì sẽ tròn xoe?
Rất mong được học tập kinh nghiệm từ anh.

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Một bài báo về biến nạp bằng xung điện Bacillus megaterium

Bài này nói hiệu suất max đạt được là 10^3CFU/ug

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Giá trị OD 600 khi thu tế bào làm tế bào khả biến

Một vấn đề nữa là giá trị OD 600 khi thu tế bào làm tế bào khả biến có cần chính xác là 1-2 theo protocol hướng dẫn không? nếu em lỡ nuôi vượt quá giá trị này, lên khoảng 2,5; 3 chẳng hạn thì có ảnh hưởng không tốt gì đến hiệu quả biến nạp không? Có cần thiết phải nuôi lại?

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Mình đã hoàn thành thí nghiệm và viết lại để các bạn cùng biết. Theo các nghiên cứu thế giới và thực tế kinh nghiệm của mình thì với vật chủ là B. megateirum nếu thực hiện biến nạp bằng xung điện sẽ không thành công. Mình đã làm biến nạp bằng tế bào trần, phương pháp đơn giản là xử lý lisozyme, sau đó biến nạp bằng PEG 6000, rất đơn giản mà lại hiệu quả.
Điều quan trọng thứ hai khi biến nạp vào B. megaterium, các bạn nên để ý loài này dễ bị nhiễm một loại plasmid có sẵn trong tự nhiên, cho phép nó kháng kháng sinh Tetracyclin, mà tính kháng sẽ tăng lên sau khi tiếp xúc với kháng sinh. Nghĩa là có thể bạn nuôi lỏng lần đầu trong môi trường có kháng sinh nó không mọc hoặc sống yếu ớt, nhưng để sang ngày 2, 3 nó sẽ sống rất tốt. Mà đa phần vector tải gen dùng cho B. megaterium hiện nay sử dụng kháng sinh chọn lọc là Tetaracyclin. Do đó hãy chắc chắn vật chủ của bạn không nhiễm plasmid kháng Tetaracyclin này, bởi việc một vật chủ đã mang 1 plasmid rồi, dung nạp thêm 1 plasmid nữa là hầu như không thể, hai nữa là nếu có bạn cũng không thể sàng lọc được đâu.
Chúc may mắn với ai làm vật chủ là B. megaterium