Trịnh Thị Hồng Nhung
Senior Member
Thân gửi các anh chị.
Mong anh chị nào đã từng làm biểu hiện trên Bacillus hoặc vi khuẩn Gram+ chia sẻ kinh nghiệm.
Hiện tại em đang thực hiện biểu hiện một gen trên Bacillus, cụ thể là B. megaterium.
Vấn đề em gặp phải ở đây là không thể biến nạp vector vào vật chủ được. Vector sử dụng ở đây là pSpLipA ( http://www.mobitec.com/cms/download/Handbooks/hp-Vector_Expression_Systems-Handbook.pdf )
Trên vector có gen kháng kháng sinh kháng Tetracycline, tuy nhiên dòng B. megaterium lại có thể kháng được kháng sinh này ở mức độ nhẹ, nghĩa là trong môi trường có kháng sinh chúng chỉ phát triển chậm chứ không chết. Chang tế bào chưa biến nạp trên đĩa có kháng sinh ủ thời gian khoảng 24h sẽ có khuẩn lạc mọc lên, sau đó mọc càng ngày càng nhiều. Do đó em không thể chọn lọc tế bào đã mang plasmid và chưa mang plasmid bằng phương pháp sàng lọc kháng sinh.
Để biến nạp trên vi khuẩn gram + là Bacillus em đã thử phương pháp xung điện và protoplast. Để xác định gen đã chèn vào hay chưa thì dùng phương pháp PCR clony. Tuy nhiên đã làm rất nhiều lần rồi nhưng chưa có lần nào PCR lên cả.
Muốn hỏi phải chăng việc PCR để chứng tỏ vi khuẩn đã mang plasmid là không thể vì lượng bản coppy lớn, thành tế bào dày, không tách được plasmid, gặp phải chất ức chế phản ứng PCR?
Rất mong anh, chị, các bạn cho mình ý kiến vì thực sự đã làm rất mệt mỏi mà không có kết quả.
Thân!
Mong anh chị nào đã từng làm biểu hiện trên Bacillus hoặc vi khuẩn Gram+ chia sẻ kinh nghiệm.
Hiện tại em đang thực hiện biểu hiện một gen trên Bacillus, cụ thể là B. megaterium.
Vấn đề em gặp phải ở đây là không thể biến nạp vector vào vật chủ được. Vector sử dụng ở đây là pSpLipA ( http://www.mobitec.com/cms/download/Handbooks/hp-Vector_Expression_Systems-Handbook.pdf )
Trên vector có gen kháng kháng sinh kháng Tetracycline, tuy nhiên dòng B. megaterium lại có thể kháng được kháng sinh này ở mức độ nhẹ, nghĩa là trong môi trường có kháng sinh chúng chỉ phát triển chậm chứ không chết. Chang tế bào chưa biến nạp trên đĩa có kháng sinh ủ thời gian khoảng 24h sẽ có khuẩn lạc mọc lên, sau đó mọc càng ngày càng nhiều. Do đó em không thể chọn lọc tế bào đã mang plasmid và chưa mang plasmid bằng phương pháp sàng lọc kháng sinh.
Để biến nạp trên vi khuẩn gram + là Bacillus em đã thử phương pháp xung điện và protoplast. Để xác định gen đã chèn vào hay chưa thì dùng phương pháp PCR clony. Tuy nhiên đã làm rất nhiều lần rồi nhưng chưa có lần nào PCR lên cả.
Muốn hỏi phải chăng việc PCR để chứng tỏ vi khuẩn đã mang plasmid là không thể vì lượng bản coppy lớn, thành tế bào dày, không tách được plasmid, gặp phải chất ức chế phản ứng PCR?
Rất mong anh, chị, các bạn cho mình ý kiến vì thực sự đã làm rất mệt mỏi mà không có kết quả.
Thân!