Tranh luận về protein dung hợp

[phamvanhuy14]

Tình hình là trên face lớp tôi có một cuộc tranh luận về câu viết của thầy Nguyễn Hoàng Lộc về sản xuất protein dung hợp " Dung hợp các trình tự ngoại lai với các gen của E. coli thường cho kết quả các sản phẩm ổn định hơn các protein ngoại lai nguyên thể. Con bạn hỏi "vì sao gen dung hợp cho sản phẩm protein ổn định ?". Từ "ổn định " ở trên, lớp tôi có hai hướng nghỉ: Một bên nói đó là ổn định câu trúc, một bên nói đó là ổn định lượng sản phẩm tạo ra.

 

[orion8x]

sao đọc quài mà hông có hiểu, mí anh ở trển mỗi anh dịch tiếng Anh mỗi từ một kiểu khó lường quá T___T!
Protein dung hợp là gì!? trình tự ngoại lai, protein ngoại lai nguyên thể là sao!?

Mà nói gì thì nói, nói về cấu trúc protein, đưa vào host lạ, hoặc gene lạ, hoặc bất cứ cái gì lạ thì chỉ có thể bằng hoặc thua nguyên bản chứ kg thể nào HƠN đc. Chủ thể đã tiến hóa hàng triệu năm cho cái protein đó rồi, kg đơn giản gắp râu ông nọ cắm cằm bà kia mà bảo nó hơn đc.
P/s: Mà ông thầy chỉ đích danh E. coli mới hài chứ

 

[phamvanhuy14]

khi gắn 1 gen của loài khác (gen ngoại lai) phía sau một gen của tế bào chủ ví dụ gắn một gen nào đó vào phía sau gen lac Z của E coli thì khi gen lac Z được dịch mã thì gen ngoại lai cũng được dịch mã kết quả tạo ra một chuỗi polypeptide gồm beta galactosase và protein của gen ngoại lai. chuỗi polypeptide đó là protein dung hợp đó bạn. Còn thầy Lộc nói E coli chỉ là minh chứng thôi vả lại E coli là vật chủ hay được sử dụng để biểu hiện gen ngoại lai

 

[cfareast]

protein dung hợp theo tôi hiểu là một protein có các peptide từ 2 hay 3 nguồn khác nhau, có thể có thêm protein... do gắn kết 2 hay nhiều gen vào nhau, tùy mục đích của tác giả.
Nhưng nói thật tôi đọc nhiều tài liệu về biểu hiện các gen, chưa thấy cái nào nói về tính ổn định của protein dung hợp.
Có một số bài nói về dung hợp làm tăng tính tan, hoặc làm secretion tốt hơn.. hoặc có thể đồng biểu hiện với chaperon làm tăng tính tan, ổn định (tế bào chủ nhận biết non-native protein và phân hủy chúng.

 

[orion8x]

Nếu chuỗi peptide đc thêm thắt vào 1 chuỗi peptide khác (Lac Z như bạn vd) thì khó lòng mà giữ đc tính ổn định của cấu trúc, huống chi là đc biểu hiện trong 1 host hoàn toàn lạ. Nơi mà các chaperone kg thích hợp, protein kg đc sử dụng (dẫn tới aggregation), hoặc protein kg có cơ cấu tiết ra ngoài, hoặc cơ chế kiểm duyệt hoàn toàn khác...
Có thể thầy nói về lượng sản phẩm. Mà gì thì nói, câu của thầy sai lè. Cấu trúc có ổn định hay kg thì phải xét về khả năng của host và của chính protein. Số lượng có ổn định hay kg thì phải nói thêm về hệ thống vector, promoter, môi trường nuôi cấy... chứ gene ngoại lai thì chả là cái nghĩa lý gì.

 

[Nguyễn Thế Long]

Tình hình là trên face lớp tôi có một cuộc tranh luận về câu viết của thầy Nguyễn Hoàng Lộc về sản xuất protein dung hợp " Dung hợp các trình tự ngoại lai với các gen của E. coli thường cho kết quả các sản phẩm ổn định hơn các protein ngoại lai nguyên thể. Con bạn hỏi "vì sao gen dung hợp cho sản phẩm protein ổn định ?". Từ "ổn định " ở trên, lớp tôi có hai hướng nghỉ: Một bên nói đó là ổn định câu trúc, một bên nói đó là ổn định lượng sản phẩm tạo ra.

Đây là ổn định cấu trúc bạn ạ !
Câu nói của thầy Lộc là hoàn toàn chính xác, lý do như sau:

1. Protein có cấu trúc lớn thường ổn định (ít bị degradation) hơn các protein có cấu trúc nhỏ do các vị trị mẫn cảm với protease được che khuất ở bên trong. Do vậy, dễ hiểu rằng ghi ghép cái module protein nhỏ lại thành 1 protein lớn hơn thì trên lý thuyết nó sẽ ổn định hơn.
Protein ngoại lai cần tổng hợp càng nhỏ thì nó càng cần ghép với 1 protein lớn hơn để ổn định cấu trúc.

2. Trong trường hợp host cell là E. coli thì việc gắn protein ngoại lai với 1 protein của chính E. coli lại càng dễ tăng cường tính ổn định của recombinant protein. Lý do rất đơn giản: module protein có nguồn gốc E. coli dễ dàng đc tổng hợp và duy trì ổn định cấu trúc của nó (trong tế bào E. coli), vậy nên nó tăng cường tính ổn định cho cả khối (tức cả phân tử protein tái tổng hợp).

 

[orion8x]

E.coli kg biểu hiện tốt các protein lớn (>70kDa), do đó khó mà biểu hiện 1 protein dung hợp nếu kg có fusion tag (Thioredoxin hoặc GST). Vả lại trước giờ chưa thấy ai dung hợp gene của Host (Lac Z chẳng hạn như chủ thớt vd) để tăng tính ổn định của protein. Thay vào đó, ng ta chú ý tới fusion tag và promoter nhiều hơn.
Và theo hiểu biết hạn hẹp của tui thì kg ai dám khẳng về tính tương quan giữa độ dài của protein và tính ổn định của nó!? Ít nhất có 1 article, nhưng nó chỉ dừng lại ở mức thống kê và chứng minh hoàn toàn ngược lại.

 

[phongvu]

topic naỳ hót quá, đọc thì thấy câu nói mà chủ thớt trích dẫn rất là ấn tượng.......không hiểu người nói câu này trích dẫn từ nguồn nào hay là kinh nghiệm cá nhân???theo mình biết thì chỉ có gen ngoại lai được dung hợp với các fusion tag khác rồi đưa vào một cơ thể sinh vật nhằm tạo cho nó khả năng ổn định ở một mức nào đó trong quá trình dịch mã để không bị các protease cắt vụn nghĩa là làm cho quá trình dịch mã được diễn ra liên tục, hoặc có thể dung hợp một tag khác làm cho protein của cái gen đó có cấu trúc không gian phù hợp nào đó chứ mình cũng chưa từng nghe thấy nói gen ngoại lai được gắn với gen của cơ thể vật chủ như chủ thớt trích dẫn,,,,,có lẽ đây là thủ thuật người ta muốn chia sẻ để hướng cho sinh viên lớp sau đạt thành công!
p/s mình đồng ý với anh orion8x....

 

[phamvanhuy14]

Cảm ơn mọi người đã quan tâm!!!!
mọi người vào đây tải sách của thầy nè: https://skydrive.live.com/redir?resid=B4D3D692A0374AB6!159&authkey=!AI3G59HhyETmZYg
trang 105, mục I: sản xuất protein dung hợp.
việc gắn gen ngoại lai phía sau một gen của tế bào vật chủ để tạo ra protein dung hợp mình khẳng định là có. sản xuất insulin cũng là kiểu này đó.

 

[Nguyễn Thế Long]

Có lẽ không cần phải đụng tới báo chuyên ngành để giải quyết được vấn đề này vì thực ra, kiến thức này mình từng được dạy chính quy trên lớp bởi 1 giáo sư đầu ngành về kĩ thuật dy truyền. Trong sách của vị giáo sư này có viết như sau:
"Ưu điểm đầu tiên của việc dung hợp protein ngoại lai và protein của tế bào vật chủ là tính ổn định của protein tải tổ hợp được tăng cường mạnh mẽ. Protein ngoại lai tái tổ hợp mà đặc biệt là các phân tử polypeptide nhỏ rất dễ bị hệ thống enzym protease trong E. coli phân giải, nguyên nhân là do protein ngoại lai và các polypeptide ngắn không thể hình thành cấu trúc không gian 1 cách chính xác, khiến các vị trí mẫn cảm với protease trên mạch polypeptide bị lộ ra ngoài. Trong trường hợp của protein dung hợp, protein của vật chủ và protein ngoại lai có thể phần nào đó hình thành 1 cấu trúc không gian phức tạp hơn, tuy nó không hoàn toàn giống với cấu trúc tự nhiên của 2 protein khi tồn tại riêng rẽ nhưng ở 1 mức độ khá lớn đã phong toả các vị trí (thuộc protein ngoại lai) mẫn cảm với protease, từ đó tăng cường tính ổn định. Mặt khác, trong nhiều trường hợp, protein dung hợp còn có tính tan trong nước khá tốt, do đó có thể thực hiện 1 phần hoạt tính sinh hoá vốn có."

Còn thì protein dung hợp sau khi được tổng hợp và phân lập (thường bằng sắc ký ái lực thông qua tương tác với antibody, ligands hoặc substrates,...) thì có thể dùng 1 số enzym protease cắt đặc hiệu để cắt bỏ đoạn protein của E. coli đi. Trong trường hợp tổng hợp insulin, cũng là do đoạn polypeptide ngoại lai không hình thành đc cấu trúc không gian chính xác nên mới phải biểu hiện cùng B-galactosidase.

 

[trinhtan]

Có lẽ không cần phải đụng tới báo chuyên ngành để giải quyết được vấn đề này vì thực ra, kiến thức này mình từng được dạy chính quy trên lớp bởi 1 giáo sư đầu ngành về kĩ thuật dy truyền. Trong sách của vị giáo sư này có viết như sau:
"Ưu điểm đầu tiên của việc dung hợp protein ngoại lai và protein của tế bào vật chủ là tính ổn định của protein tải tổ hợp được tăng cường mạnh mẽ. Protein ngoại lai tái tổ hợp mà đặc biệt là các phân tử polypeptide nhỏ rất dễ bị hệ thống enzym protease trong E. coli phân giải, nguyên nhân là do protein ngoại lai và các polypeptide ngắn không thể hình thành cấu trúc không gian 1 cách chính xác, khiến các vị trí mẫn cảm với protease trên mạch polypeptide bị lộ ra ngoài. Trong trường hợp của protein dung hợp, protein của vật chủ và protein ngoại lai có thể phần nào đó hình thành 1 cấu trúc không gian phức tạp hơn, tuy nó không hoàn toàn giống với cấu trúc tự nhiên của 2 protein khi tồn tại riêng rẽ nhưng ở 1 mức độ khá lớn đã phong toả các vị trí (thuộc protein ngoại lai) mẫn cảm với protease, từ đó tăng cường tính ổn định. Mặt khác, trong nhiều trường hợp, protein dung hợp còn có tính tan trong nước khá tốt, do đó có thể thực hiện 1 phần hoạt tính sinh hoá vốn có."

Còn thì protein dung hợp sau khi được tổng hợp và phân lập (thường bằng sắc ký ái lực thông qua tương tác với antibody, ligands hoặc substrates,...) thì có thể dùng 1 số enzym protease cắt đặc hiệu để cắt bỏ đoạn protein của E. coli đi. Trong trường hợp tổng hợp insulin, cũng là do đoạn polypeptide ngoại lai không hình thành đc cấu trúc không gian chính xác nên mới phải biểu hiện cùng B-galactosidase.

bạn ơi sách đó là sách gì vậy

 

[orion8x]

Còn thì protein dung hợp sau khi được tổng hợp và phân lập (thường bằng sắc ký ái lực thông qua tương tác với antibody, ligands hoặc substrates,...) thì có thể dùng 1 số enzym protease cắt đặc hiệu để cắt bỏ đoạn protein của E. coli đi. Trong trường hợp tổng hợp insulin, cũng là do đoạn polypeptide ngoại lai không hình thành đc cấu trúc không gian chính xác nên mới phải biểu hiện cùng B-galactosidase.

Seriouly!?
Tôi kg biết GS đầu nghành của bạn là ai, nhưng tui cá bạn hiểu sai chức năng của Lac Z đc biểu hiện chung trong khi sản xuất Insulin.
Chắc bạn biết chủng E.coli đc dùng để sản xuất protein đều là loại đc loại bỏ protease (protease-deficient host), và chức năng của Lac Z trong biểu hiện protein hoàn toàn kg liên quan đến cấu trúc của protein ngoại lai mà là điều khiển phiên mã, hay chính xác hơn là điều khiển tốc độ phiên mã của đoạn gene đc dung hợp!

 

[Nguyễn Thế Long]

Hic, mới có 1 khoảng thời gian ngắn mà động đến cái gì cũng phải giở sách ra mới nhớ, chán mình quá. Dù sao thì cũng cảm ơn cái topic này mà mình có cơ hội ôn lại kiến thức !

Rất tiếc vị Giáo sư mình đề cập là người TQ và sách cũng là sách tiếng Trung nên ...
Còn về vấn đề đang thảo luận thì mình thấy bạn (và cả bạn chủ topic) đang có 1 chút nhầm lẫn giữa lacZ (1 dạng promoter) và B-galactosidase (protein dung hợp với insulin).

1. Đúng như bạn orion8x nói, lacZ là promoter, nghĩa là nó nằm ở upstream (trước mã khởi đầu ATG) của gen cần biểu hiện, do đó protein dung hợp được tổng hợp không thể chứa lacZ.
Như vậy, bạn chủ topic đã hiểu nhầm rằng lacZ được biểu hiện cùng gen ngoại lai.

2. Trong trường hợp sx insulin, protein dung hợp thực ra bao gồm insulin và B-galactosidase. Và rõ ràng rằng người ta phải có lý do khi làm như vậy: Việc gắn 1 gen của host vào trước gen mã hoá insulin sẽ tăng cường độ biểu hiện và tính ổn định của protein dung hợp.
Chú ý là insulin đc tổng hợp theo cách này sẽ nằm trong thể vùi (inclusion body), do đó càng ít bị degraded hơn.

P/S: trong post lần trước, mình có nói "do đoạn polypeptide ngoại lai không hình thành đc cấu trúc không gian chính xác nên mới phải biểu hiện cùng B-galactosidase". Cái này thì ko chính xác lắm, thực ra người ta làm vậy chủ yếu là để tăng sản lượng, hơi nhầm nhọt tí
Anyway, debating is a good way to review and improve our expertise, so take it easy

 

[phamvanhuy14]

nếu dùng lac z đề biểu hiện các gen ngoại lai thì polypeptide tạo ra sẽ có hai hai trình tự peptide, một của gen trong vi khuẩn, một mã hóa bởi gen ngoại lai. còn muốn tạo chuỗi polypeptide chỉ có trình tự amino acid của gen ngoại lai thì khi đó chỉ dùng một promoter mạnh của prokaryote và trình tự gắn ribosome hiệu quả, protein tạo ra bằng cách này gọi là protein nguyên thể. mình đọc lại sách của thầy rồi đó là ổn định cấu trúc. để vài bữa lên hỏi thầy lại thử, hihi