Nguyên nhân thất bại của thí nghiệm cloning?

[anhtrungbio]

Kính chào các bác

Em đang làm thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp dùng plasmid pGEMT easy để clone 2 đoạn gen dài 2.5 và 3.4kb. Đồng thời dùng pBluescript SK+ để clone 1 đoạn khác dài 3kb. Cả 3 vector đều biến nạp vào E.coli DH5 alpha.

Cả 3 thí nghiệm đều dùng Blue/white screening trên môi trường LB + ampicillin + X-gal.
Tuy nhiên, số khuẩn lạc thu được rất ít. Sau khi tiếp tục nuôi các colony màu trắng trong LB lỏng, tách plasmid và kiểm tra trên gel thì thấy toàn thu được plasmid rỗng (ko có insert).

Điều mà em ko hiểu là tại sao plasmid tách từ khuẩn lạc trắng lại không mang đoạn insert? Phải chăng giai đoạn ligation bị lỗi? Có điều đáng chú ý là trong cả 2 thí nghiệm ligation trước đó thì nồng độ đoạn insert là thấp hơn so với vector. Liệu đó có phải nguyên nhân thất bại?

Em đang làm lại thí nghiệm từ đầu, với mục đích làm tăng nồng độ các đoạn insert xem thế nào.
Xin các bác cho em vài kinh nghiệm quý báu.
Chân thành cảm ơn!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Số khuẩn lạc ít có thể là vấn đề. Bạn nên xem lại ligase và competent cell. Việc tách colony trắng không mang insert là chuyện thường gặp trong cloning. Không có lý giải rõ ràng nhưng trong trường hợp bạn có ít colony thì nên nhặt tất (cả trắng cả xanh) và kiểm tra.
Với insert kha khá như thế bạn nên dùng one-step miniprep size check để screen lấy candidate transformants trước khi miniprep nó và cắt kiểm tra.

Thông thường với pGEMT easy thì tôi pha loãng stock của cty thành 10 lần và mỗi lần dùng khoảng từ 1-2 ul. Thường thì tôi dùng pGEMT để TA clone thôi vì nó có sẵn đầu T rồi. Còn subcloning thì thường dùng pBSSK.

Bạn nên chú ý nồng độ ligase của bạn nữa vì không hiểu sao có nhiều sản phẩm ligase nồng độ rất loãng. Thông thường tôi xài Takara T4 ligase (350 u/ul) và xài 1 ul cho 1 phản ứng ligation. Với kích thước trên 1kb như vậy bạn nên để ít nhất là 8 tiếng ở 16 C.

 

[anhtrungbio]

Số khuẩn lạc ít có thể là vấn đề. Bạn nên xem lại ligase và competent cell. Việc tách colony trắng không mang insert là chuyện thường gặp trong cloning. Không có lý giải rõ ràng nhưng trong trường hợp bạn có ít colony thì nên nhặt tất (cả trắng cả xanh) và kiểm tra.
Với insert kha khá như thế bạn nên dùng one-step miniprep size check để screen lấy candidate transformants trước khi miniprep nó và cắt kiểm tra.

Thông thường với pGEMT easy thì tôi pha loãng stock của cty thành 10 lần và mỗi lần dùng khoảng từ 1-2 ul. Thường thì tôi dùng pGEMT để TA clone thôi vì nó có sẵn đầu T rồi. Còn subcloning thì thường dùng pBSSK.

Bạn nên chú ý nồng độ ligase của bạn nữa vì không hiểu sao có nhiều sản phẩm ligase nồng độ rất loãng. Thông thường tôi xài Takara T4 ligase (350 u/ul) và xài 1 ul cho 1 phản ứng ligation. Với kích thước trên 1kb như vậy bạn nên để ít nhất là 8 tiếng ở 16 C.

Cảm ơn bác đã chia sẻ.

Em nghĩ là competent cell chắc là vẫn ổn, vì trước đó em TA clone 1 đoạn khác cũng dài 3kb vào pGEMT lên ngon lành. Em đang dùng pGEMT do mọi người trong lab chia sẵn thành các tube, mỗi tube đựng đúng 1ul nên ko rõ tỷ lệ pha loãng thế nào.

Đúng như bác nói, em cũng TA clone trong pGEMT sau đó sẽ subclone trong pBSSK.

Về ligase, khi TA clone thì em dùng T4 ligase 3u/ul của Promage đi kèm.
Còn khi subclone thì em dùng T4 ligase 1000 CEU/ul của Fermentas.

Về thời gian, với TA clone em để trong nhiệt độ phòng khoảng 3 - 4 tiếng, sau đó ủ qua đêm ở 4 độ C.
Còn với subclone: 22 độ C (4h), 4 độ C (10h), 70 độ C (5'), 4 độ C - forever.

Theo bác thì quy trình như vậy có ổn không?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thông thường tôi ligase ở 16 độ overnight (8 tiếng), với thể tích là 10 ul. Sau đó dùng khoảng 2-5 ul biến nạp và phần còn lại cất 4 độ. Nếu không ra thì làm tiếp phần còn lại.

Nếu bạn cảm thấy số lượng colony ít thì bạn nên tăng thể tích trải, bằng cách ly tâm nhẹ để tủa tế bào transformant rồi trải 1/2 hoặc trải tất lên 1 dĩa.

 

[anhtrungbio]

Thông thường tôi ligase ở 16 độ overnight (8 tiếng), với thể tích là 10 ul. Sau đó dùng khoảng 2-5 ul biến nạp và phần còn lại cất 4 độ. Nếu không ra thì làm tiếp phần còn lại.
Nếu bạn cảm thấy số lượng colony ít thì bạn nên tăng thể tích trải, bằng cách ly tâm nhẹ để tủa tế bào transformant rồi trải 1/2 hoặc trải tất lên 1 dĩa.

Bác chia đôi lượng ligation như thế liệu có làm giảm số thể biến nạp thu được? Bác biến nạp 2-5ul cho 100 hay 200 ul competent cell?
Em biến nạp cả 10ul ligation cho 200 ul cell.

Em đã PCR lại cả 2 đoạn insert và thu được 1 lượng khá lớn, đồng thời cũng digestion 1 đoạn insert khác đã gắn vào pGEMT chuẩn bị subcloning trong pBSSK, nồng độ cũng cao hơn lần trước.

Em có trao đổi với anh tutor trong Lab thì anh ấy bảo có thể do cell không đủ độ competent. Tuần sau em sẽ chuẩn bị lại cell. Bác có kinh nghiệm nào trong việc này không ạ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Nói chung tôi ít có vấn đề về cloning nên những thao tác đó là phòng ngừa thôi bạn ạ. Nếu bạn cho lượng insert với vector vào nhiều thì 2ul cũng đủ mà.
Tôi dùng 200 ul competent cell.
Có lẽ ligase của lab tôi khá tốt nên không có vấn đề gì về cloning.
Về ligation và biến nạp thì nói chung bạn làm đều tay nó sẽ ổn thôi. Ngoài nguyên nhất thất bại về hóa chất thì đôi khi do pứ ligation thực sự khó. Ví dụ bạn tôi hay phải nối vào binary vector ở thực vật với kích thước 13 kbp thì lắm lúc trải toàn bộ tube tế bào khả biến chi được đúng 2 colony và là positive colony luôn.

 

[Dương Văn Cường]

Kinh nghiệm của mình cho thấy tỉ lệ vector - insert ảnh hưởng đáng kể đến kết quả cloning. 2 tuần trước mình vừa làm 1 thí nghiệm với 2 tỉ lệ 1:3 và 1:6, tất cả các yếu tố khác giống nhau. Kết quả là tỉ lệ 1:3 không thu được khuẩn lạc nào còn 1:6 được 8 khuẩn lạc và 7 trong số đó có insert. Vector của mình kích thước 12 KB còn insert là 1.4 KB.

 

[anhtrungbio]

Kinh nghiệm của mình cho thấy tỉ lệ vector - insert ảnh hưởng đáng kể đến kết quả cloning. 2 tuần trước mình vừa làm 1 thí nghiệm với 2 tỉ lệ 1:3 và 1:6, tất cả các yếu tố khác giống nhau. Kết quả là tỉ lệ 1:3 không thu được khuẩn lạc nào còn 1:6 được 8 khuẩn lạc và 7 trong số đó có insert. Vector của mình kích thước 12 KB còn insert là 1.4 KB.

Em đã hỏi mấy đứa bạn trong lab và xem trên các trang thông tin khác, và phát hiện ra 1 nguyên nhân quan trọng: có thể trong quá trình purify vector và insert đã làm mất các đầu dính, do tác động của tia UV và quá trình purify.
Vì thế em quyết định chơi "quick and dirty" => kết quả thật mỹ mãn, khuẩn lạc mọc lên như nấm Và tất nhiên em phải chọn lọc để thu được plasmid mong muốn.
Em thấy chơi kiểu này nhanh và dễ thành công với tỷ lệ khá cao.