anhtrungbio
Senior Member
Kính chào các bác
Em đang làm thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp dùng plasmid pGEMT easy để clone 2 đoạn gen dài 2.5 và 3.4kb. Đồng thời dùng pBluescript SK+ để clone 1 đoạn khác dài 3kb. Cả 3 vector đều biến nạp vào E.coli DH5 alpha.
Cả 3 thí nghiệm đều dùng Blue/white screening trên môi trường LB + ampicillin + X-gal.
Tuy nhiên, số khuẩn lạc thu được rất ít. Sau khi tiếp tục nuôi các colony màu trắng trong LB lỏng, tách plasmid và kiểm tra trên gel thì thấy toàn thu được plasmid rỗng (ko có insert).
Điều mà em ko hiểu là tại sao plasmid tách từ khuẩn lạc trắng lại không mang đoạn insert? Phải chăng giai đoạn ligation bị lỗi? Có điều đáng chú ý là trong cả 2 thí nghiệm ligation trước đó thì nồng độ đoạn insert là thấp hơn so với vector. Liệu đó có phải nguyên nhân thất bại?
Em đang làm lại thí nghiệm từ đầu, với mục đích làm tăng nồng độ các đoạn insert xem thế nào.
Xin các bác cho em vài kinh nghiệm quý báu.
Chân thành cảm ơn!
Em đang làm thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp dùng plasmid pGEMT easy để clone 2 đoạn gen dài 2.5 và 3.4kb. Đồng thời dùng pBluescript SK+ để clone 1 đoạn khác dài 3kb. Cả 3 vector đều biến nạp vào E.coli DH5 alpha.
Cả 3 thí nghiệm đều dùng Blue/white screening trên môi trường LB + ampicillin + X-gal.
Tuy nhiên, số khuẩn lạc thu được rất ít. Sau khi tiếp tục nuôi các colony màu trắng trong LB lỏng, tách plasmid và kiểm tra trên gel thì thấy toàn thu được plasmid rỗng (ko có insert).
Điều mà em ko hiểu là tại sao plasmid tách từ khuẩn lạc trắng lại không mang đoạn insert? Phải chăng giai đoạn ligation bị lỗi? Có điều đáng chú ý là trong cả 2 thí nghiệm ligation trước đó thì nồng độ đoạn insert là thấp hơn so với vector. Liệu đó có phải nguyên nhân thất bại?
Em đang làm lại thí nghiệm từ đầu, với mục đích làm tăng nồng độ các đoạn insert xem thế nào.
Xin các bác cho em vài kinh nghiệm quý báu.
Chân thành cảm ơn!