Tinh sạch protein thể vùi

[phongvu]

mong được chia sẻ từ các bác trên diễn đàn: em đang làm việc với một protein, kích thước nó 22kDa thêm cái đuôi his6 nữa.Em biểu hiện nó trong tế bào ecoli BL21, sau khi xác định trạng thái thu được nó tồn tại ở dạng thể vùi ở trong khoảng nhiệt sử dụng:18,30,32,37 hết.Vấn đề là em dùng urea biến tính nó và tinh chế hybrid thì nó cứ out qua cột khoảng chừng 30-40%,khi rửa nó cũng out mất một ít và khi đẩy bằng imidazole thì nó ra band nhỏ, hơn nữa cũng không có sạch lắm,lượng pro thu được này không đủ để đem đi gây kháng thể.Câu hỏi đặt ra là làm sao tối ưu được bám cột và thu được một lượng pro lớn?Mong các bác có kinh nghiệm thì chia sẻ cho em với.
P/s em đã từng làm native, denature nhưng đều thu được kết quả không khả quan, band nhỏ,không sạch em đang rối chưa biết xử lý tiếp thế nào?

 

[cfareast]

mong được chia sẻ từ các bác trên diễn đàn: em đang làm việc với một protein, kích thước nó 22kDa thêm cái đuôi his6 nữa.Em biểu hiện nó trong tế bào ecoli BL21, sau khi xác định trạng thái thu được nó tồn tại ở dạng thể vùi ở trong khoảng nhiệt sử dụng:18,30,32,37 hết.Vấn đề là em dùng urea biến tính nó và tinh chế hybrid thì nó cứ out qua cột khoảng chừng 30-40%,khi rửa nó cũng out mất một ít và khi đẩy bằng imidazole thì nó ra band nhỏ, hơn nữa cũng không có sạch lắm,lượng pro thu được này không đủ để đem đi gây kháng thể.Câu hỏi đặt ra là làm sao tối ưu được bám cột và thu được một lượng pro lớn?Mong các bác có kinh nghiệm thì chia sẻ cho em với.
P/s em đã từng làm native, denature nhưng đều thu được kết quả không khả quan, band nhỏ,không sạch em đang rối chưa biết xử lý tiếp thế nào?

Bạn cần tinh sạch nó làm kháng thể, hay cần nghiên cứu tính chất???
Theo mình thì thể vùi (inclusion body) thì cái histag nó cũng bị "vùi", nên khả năng bám hạn chế. Bạn cần hòa tan trong Ure 2-6M (cần phải dò xem nó tan ở khoảng nào), rồi tinh sạch qua cột histag binding (Ni++). Hoặc bạn có thể làm renature , rồi thẩm tích loại ure, rồi lên cột.
Tóm lại bạn phải có phương pháp xác định nó là active protein.

Nếu không được, cần phải dùng cột khác (Sephedex...). Đảm bảo là được...

Nhưng tóm lại, nếu tinh sạch được... cái protein đó có cần phải có hoạt tính hay không? Nếu dùng để tạo kháng thể, thì dạng inactive (or active) cũng được, nhưng phải là soluble protein.

Còn nếu đẩy ra band nhỏ??? thì chắc không phải protein đó (hoặc trong quá trình làm, bị protease cắt. Vì theo mình Ure không làm đứt gãy protein..., chỉ làm thẳng protein.

Mọi việc đều phải mày mò!

good lucks

 

[phongvu]

Bạn cần tinh sạch nó làm kháng thể, hay cần nghiên cứu tính chất???

Bạn ạ cái pro này của mình họ đã nghiên cứu hết cả rồi, giờ mình chỉ làm để lấy nó đi gây kháng thể thôi.Thứ nhất pro này mình thu được lượng ít không đủ gây miễn dịch, thứ hai là nó lẫn nhiều pro khác nữa cho nên khi đem gây kháng thể thì cũng e ngại.Hầu hết nước mình toàn làm nghiên cứu khoa học ứng dụng chứ làm gì có nghiên cứu cơ bản đâu mà bạn hỏi nghiên cứu tính chất????

Theo mình thì thể vùi (inclusion body) thì cái histag nó cũng bị "vùi", nên khả năng bám hạn chế. Bạn cần hòa tan trong Ure 2-6M (cần phải dò xem nó tan ở khoảng nào), rồi tinh sạch qua cột histag binding (Ni++). Hoặc bạn có thể làm renature , rồi thẩm tích loại ure, rồi lên cột

Nếu đã biết đến như thể vùi thì nó đã không còn là pro có hoạt tính rồi bạn ạ,toàn bộ pro ấy nó folding( cuộn gập) trong một cấu trúc nào đó không có hở ra vùng nào cả, kể cả vùng his( vì ở đây his được fuse với pro rồi).Tất cả đều đã được gập hết vào trong.Mình đã tinh sạch được thể vùi và rồi biến tính bằng Urea, khi tinh chế mình đã test được nó là pro đích rồi.Khâu này không có gì để nói cả, vấn đề là ở chỗ sau denature pro này out qua cột (Ni2+-NTA) tới 30-40%, khi đẩy bằng imidazole thì thu được các band nhỏ quá.Mình muốn trao đổi xem ai có biện pháp nào giúp tối ưu hai điều này không?Mình đã tinh chế hybrid, denature, native nhưng kết quả mỗi lần đều không giống nhau, gặp phải những hiện tượng rất khác nhau.Mình đã tăng nồng độ NaCl và glyxerol lên nhưng cũng không khả quan, mình làm cả IMAC nhưng đều vô ích.Khi làm IMAC thì các fraction hầu như không có và mình thử đẩy bằng imidazole thì có 1 band khá đậm nhưng rất bẩn nên cũng bỏ đi.Thẩm tích mình cũng đã làm sau đó purify under native condition nhưng......nếu được mình đã không gửi gắm nó vào topic này bạn ak!

Tóm lại bạn phải có phương pháp xác định nó là active protein.

Biểu hiện ở tất cả dải nhiệt bên trên đều ở inclusion body bạn ạ!

Nếu không được, cần phải dùng cột khác (Sephedex...). Đảm bảo là được...

Đã đổi cột và kết quả không khả quan.Cái này đã làm nhiều rồi bạn ạ không phải là mình chưa bao giờ làm.

Nhưng tóm lại, nếu tinh sạch được... cái protein đó có cần phải có hoạt tính hay không? Nếu dùng để tạo kháng thể, thì dạng inactive (or active) cũng được, nhưng phải là soluble protein.

Sau khi purify cần có bước để refolding nó chứ nếu không thì nó chỉ là một pro ở dạng cấu trúc bậc I thôi làm sao có thể đem đi gây kháng thể được.Bạn nói có thể đi gây kháng thể bằng inactive ak???? cái này chưa từng nghe qua, bạn có biết một chất như thể nào khi vào cơ thể sẽ gây ra đáp ứng miễn dịch không???

Còn nếu đẩy ra band nhỏ??? thì chắc không phải protein đó (hoặc trong quá trình làm, bị protease cắt. Vì theo mình Ure không làm đứt gãy protein..., chỉ làm thẳng protein.

Mình test rồi bạn ạ, cái kích thước của nó sinh ra để làm gì? tất cả các thao tác đều tiến hành ở 4C không thể nào protease cắt nhanh thế hơn nữa khi đem sonicate đã bổ sung PMSF rồi nhé.Urea chỉ có tác dụng duỗi pro ra thôi hoàn toàn không thể cắt pro được nó sẽ đưa pro về dạng bậc I.

Mọi việc đều phải mày mò!

Bạn nghĩ khi làm không ra có nên thay đổi phương pháp hay làm thế nào đó tối ưu các điều kiện không? hay nên ngồi chơi post lên chờ ai đó!!!

good lucks

Thank you!
Bạn đổi thành' tinh sạch thể vùi có vẻ hot' nhỉ? nhưng mà trong khuôn khổ topic này.........bạn nên xem lại rồi thay đổi tên topic mới!

 

[cfareast]

Nói chung đề tài này phải có người tay nghề vững, chứ đưa Sinh viên hay người ko có chuyên môn lắm, thì làm sẽ sai 1 ly đi 1 dặm ko cứu được!

Bình thường, cái inclusion body tạo nên đã ở dạng tương đối sạch (có khi 90%). Nếu ko chạy được qua cột Ni++, thì dùng cột lọc gel.

Bạn hòa vào Ure, chạy SDS, ra kích thước 22kDa, ko lẽ gì lọc gel lại ko được, hoàn toàn vô lý.

Tinh sạch thì rất dễ, đã có protein thì kiểu gì cũng tách được.

Vấn đề chính ở chỗ, nếu tinh sạch được đúng 22kDa, bạn làm folding, có thế test hoạt tính, hay bằng cách nào ko?
Mò mẫm folding cho hiệu quả cũng là một vấn đề, khi mà ko có phương pháp test % correct folding? và protein của bạn ít (lạ nhỉ, inclusion body thường rất nhiều, biểu hiện 1 cục chiếm có khi 20-50% protein tổng e.coli)

Theo mình, tốt nhất bạn làm folding trước, rồi tinh sạch.

Vì nếu bạn tinh sạch được 1 ít, làm folding sẽ cần nhiều! sẽ ko có protein để làm.