Vai trò của UNG và dUTP

[thanhtam_2601]

Mình đang tìm hiểu về vai trò của UNG và dUTP để chống ngoại nhiễm thì gặp một vấn đề là không hiểu là nếu khuôn cũng được cho vào từ lúc ban đầu thì nó cũng sẽ nhân lên giống như DNA ngoại nhiễm vào có sự thay thể T thành U và sẽ bị phá hủy bằng UNG ( uracil - N- glycosyl)?
Còn nếu cho DNA khuôn vào sau thì vẫn có thể bị nhiễm DNA bên ngoài qua quá trình mở nắp hoặc Pipet?

 

[Cao Xuân Hiếu]

treat DNA template by UNG before amplification

 

[thanhtam_2601]

Nếu xử lý DNA khuôn trước với UNG và dUTP thì liệu DNA của mình có bị tổng hợp sau đó tạo các điểm nick giống như các DNA ngoại lai không? và tại sao khi xử lý như thế này thì DNA mình quan tâm lại không bị ảnh hưởng mà chỉ có các DNA ngoại lai thôi?

 

[Ho Huu Tho]

ADN ngoại lai nói tới ở đây chỉ các sản phẩm của phản ứng PCR trước đó, sản phẩm PCR này có chứa dUTP và là nguy cơ ngoại nhiễm lớn nhất nếu không được kiểm soát.

 

[nthanh]

Có thế tóm tắt các bước như sau:

Master mix (UNG, dUTP, polymerase, dNTP...) + template để PCR. Sản phẩm PCR sẽ bao gồm có các điểm có UTP.

Các phản ứng PCR khác cũng như vậy, nếu các sản phẩm PCR này nhiễm vào phản ứng PCR tiếp theo của bạn (đây là nguồn dễ gây nhiễm nhất). Và khi nhiễm các sản phẩm PCR này vào thì nó sẽ bị sử lý = UNG trong Master mix, còn template mới của bạn không bị sao vì không DNA của bạn ko có UTP. Bước sử lý nhiễm thường 40 độ trong vài phút. Sau đó mới vào các chu kỳ khuếch đại PCR thông thường, có giai đoạn biến tính, UNG sẽ bị bất hoạt luôn trong giai đoạn này.

Các phản ứng PCR hiện nay thường dùng polymerase được hoạt hóa = nhiệt (thường 95 độ 10 phút) khi đó nó mới được hoạt hóa, chính lúc này UNG sẽ bị bất hoạt. Vì vậy không có lo chuyện DNA template của bạn bị nhân lên trước và bị cắt mất.

Trong trường hợp bạn dùng polymerase bình thường, thì không có chuyện tự xảy ra phản ứng PCR ở điều kiện thường như bạn lo bạn ạ. Mà giả sử nhân được đi nữa thì nó bị cắt là cắt cái mạch tổng hợp mới , có UTP chứ có cắt mạch gốc của bạn đâu nhỉ?

 

[thanhtam_2601]

vì đã trả lời cho vấn để của mình.
Theo cách các bạn giải thích thì nguồn DNA bị nhiễm ở đây chỉ là các sản phẩm PCR cũ được khuếch đại với T thay bằng U đúng không? Còn các DNA khác có nu T mà không phải là U từ phòng thí nghiệm thì không thể loại bỏ bằng cách này nhưng đối với phòng thí nghiệm SHPT thì làm việc nhiều với các nu T.

Có phải cái này chỉ dùng được với các phòng xét nghiệm chuẩn đoán thôi vì sản phẩm khuếch đại sẽ luôn để ở dạng nu U trên phân tử DNA và liệu người ta có sử dụng được sản phẩm này để nhân lên tiếp ví dụ trong Nested PCR không vì lần đầu PCR1 sợ nhiễm nên mới dùng UNP thì lần tiếp theo người ta sử dụng chính sản phẩm PCR 1 làm khuôn thì lấy cái gì để tránh nhiễm từ nguồn DNA ngoại lai?

Thêm một câu hỏi nữa có phải dUTP chỉ có vai trò sau khi UNP bị bất hoạt và việc sử dụng dNTP có phải là gồm cả 4 nu (A,T,G,C) làm cho sản phẩm PCR vừa có cả nu T và U không?

 

[nthanh]

Dùng UNG để tránh nhiễm với nguy cơ cao nhất là sản phẩm PCR trước đó. Còn bạn vẫn phải chạy đối chứng âm để kiểm soát nhiễm nữa cơ mà (cho nguồn nhiễm khác). Còn về nested PCR thì mình nghĩ là bạn hiểu vì sao mà phải chạy nested rồi, và nếu làm thì mình nên chạy PCR1 = phản ứng không sử dụng dUTP mà vẫn dùng UNG, PCR2 thì dùng UNG và dUTP như bình thường là Ok, nhớ chạy đối chứng âm. Nói thực mình cũng chưa gặp những trường hợp nào thế cả, bạn nên tìm và đọc thêm tài liệu cho câu hỏi khá thú vị mà bạn đặt ra.
dUTP chỉ với tỉ lệ nhỏ thôi còn phần chính vẫn là dNTP bạn ạ