Thắc mắc thực nghiệm về biểu hiện và tinh sạch protein

[Huỳnh Chấn Khôn]

Thắc mắc thực nghiệm về biểu hiện và tinh s?

Em đang làm về protein engineering. Mục đích của đề tài là tạo đột biến để nâng cao hoạt tính và ái lực của protein (trong trường hợp này là ligand) với receptor của nó.

Em tạo đột biến bằng site-directed mutagenesis (PCR) và chuyển gen vào XL1-BLUE. Em đã thành công với 1 đột biền và đặt tên protein này là mut.1 . Nhưng đang gặp rắc rối với 2 đột biến là mut.2 và mut.3 . Ở mut.2, khi ly trích protein (protein purifiication) thì lượng protein thu được rất thấp. Em nghĩ là có thể do điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ) (em đã thử nuôi cấy qua đêm ở 25o,20o và 18o sau khi bỏ 0,5uM IPTG vào) và lượng IPTG bỏ vào không phù hợp. Em không biết nghĩ như vậy có đúng không và nếu như em tăng lượng IPTG thì kết quả thu được có cải thiện không?

Còn đối với mut.3 thì gen này biểu hiện rất tốt (em có kiểm tra thử protein tổng số và nhận thấy band protein mong muốn rất đậm), nhưng những band em protein do em ly trích thì nhạt hơn và có lẫn một band tạp (band này đậm gần bằng band chình của em). Em đã thử tăng nồng độ immidazole trong wshing buffer(10mM lên 15mM,20mM,25mM,30mM) và cũng thử thêm 10% glycerol vào washing buffer nhưng band tạp vẫn xuất hiện.  
Anh chị có kinh nghiệm, xin anh chị góp ý kiến giùm em,em cám ơn.

À, em tinh sạch protein bằng TALON resin với hàm lượng các bufer như sau:

Binding buffer: 50mM Sodium phosphate
                       300 mM NaCl
                       5mm immidazole.
Washing buffer: 50mM Sodium phosphate
                       300 mM NaCl
                       15mm immidazole.
Elution buffer:50mM Sodium phosphate
                       300 mM NaCl
                      200mm immidazole.
Tất cả buffer đều có pH 7.0

Em cám ơn .



Chỉnh sửa tiêu đề và định dạng bài viết bởi DVC, ngày 24 tháng 10 năm 2006
Tiêu đề cũ: Protein engineering ?(lỗi tiêu đề chung chung, quá rộng)

 

[Cao Xuân Hiếu]

Re: Protein engineering

Ở mut.2, khi ly trích protein (protein purifiication) thì lượng protein thu được rất thấp. Em nghĩ là có thể do điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ) (em đã thử nuôi cấy qua đêm ở 25o,20o và 18o sau khi bỏ 0,5uM IPTG vào) và lượng IPTG bỏ vào không phù hợp. Em không biết nghĩ như vậy có đúng không và nếu như em tăng lượng IPTG thì kết quả thu được có cải thiện không?

Nên kiểm tra xem protein của bạn có nằm trong inclusion body không rồi mới thay đổi các điều kiện. Hiệu suất bạn thu được bao nhiêu mg protein/ml dịch nuôi? Bạn có bổ sung protease inhibitor vào ko? ?

Còn đối với mut.3 thì gen này biểu hiện rất tốt (em có kiểm tra thử protein tổng số và nhận thấy band protein mong muốn rất đậm), nhưng những band em protein do em ly trích thì nhạt hơn và có lẫn một band tạp (band này đậm gần bằng band chình của em). Em đã thử tăng nồng độ immidazole trong wshing buffer(10mM lên 15mM,20mM,25mM,30mM) và cũng thử thêm 10% glycerol vào washing buffer nhưng band tạp vẫn xuất hiện.  
Anh chị có kinh nghiệm, xin anh chị góp ý kiến giùm em,em cám ơn.

Khi thôi protein ra bạn chỉ dùng 200mM immidazole ah? sao ko dùng thử grandien 80mM, 120mM, 160mM, 200mM và 300mM. Lúc đó phân đoạn 160, 200mM sẽ sạch hơn. Tuy nhiên không thể loại bỏ hết protein tạp từ E.coli đâu. Nếu muốn kiểm tra thì bạn phải nhuộm Ag thì sẽ thấy phân đoạn cũng ko thể nào sạch hết được vì trong cytoplasmic protein của E.coli cũng rất nhiều protein chứ His. Thông thường bây giờ người ta thường nhét thêm 1 tag nữa vào, tinh sạch qua 2 tag thì cực kỳ sạch. Tùy vào yêu cầu thí nghiệm của bạn. Tôi thì hay nhét strep tag.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Em không biết nghĩ như vậy có đúng không và nếu như em tăng lượng IPTG thì kết quả thu được có cải thiện không?

Cái này còn tùy vào protein của em. Tốt nhất em thí nghiệm 1 dải nồng độ IPTG từ 0,1 đến 2mM.

Việc có lẫn băng tạp có thể do 2 khả năng

1. Protein tạp cũng chứa his-tag

2. Protein tạp gắn với protein của bạn

Với trường hợp 1 thì bó tay rồi, cần tìm cách tinh sạch khác.

Với trường hợp 2 bạn thay đổi các nồng độ immidazole, thêm beta-mecaptoethanol, ethanol, triton... vào washing buffer xem sao.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em đã thử tăng nồng độ immidazole trong washing buffer rồi. Để em thử dùng Trition xem sao.Hi vọng sẽ đạt kết quả tốt.
Em cám ơn các anh.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

À,em xin trả lời câu hỏi của anh Hiếu:

Nên kiểm tra xem protein của bạn có nằm trong inclusion body không rồi mới thay đổi các điều kiện. Hiệu suất bạn thu được bao nhiêu mg protein/ml dịch nuôi? Bạn có bổ sung protease inhibitor vào ko?  

Em có thêm PMSF vào khi đánh sóng (sonication). Về hiệu suất thu protein thì do khi điện di SDS-PAGE, em thấy lượng protein thu được ít quá,với lại có tạp nữa,nên em đã bỏ đi, không định lượng protein.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

sonication = siêu âm

 

[Cao Xuân Hiếu]

Còn 1 vấn đề là Khôn đã kiểm tra protein của mình trong inclusion bodies chưa? Thông thường với các hệ plasmid nhiều copy và promoter mạnh nên lượng protein sản xuất nhiều đã bị đóng gói lại trong inclusion body.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Hiếu,

Do em mới tiếp cận với lĩnh vực Protein này mới có 1 tháng nên có nhiều kiến thức về protein em vẫn chưa nắm rõ. Anh có thể giải thích thêm cho em về việc đóng gói protein trong inclusion body không? Và làm cách nào để kiểm tra protein của mình có ở trong inclusion body không?
Nếu được thì anh giới thiệu cho em một số tài liệu về vấn đề này được không?
Em cám ơn.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Anh Hiếu,

Do em mới tiếp cận với lĩnh vực Protein này mới có 1 tháng nên có nhiều kiến thức về protein em vẫn chưa nắm rõ. Anh có thể giải thích thêm cho em về việc đóng gói protein trong inclusion body không? Và làm cách nào để kiểm tra protein của mình có ở trong inclusion body không?
Nếu được thì anh giới thiệu cho em một số tài liệu về vấn đề này được không?
Em cám ơn.

Em có thể tìm bất cứ tài liệu nào nói về biểu hiện protein trong E.coli, các kit tinh sạch, các vector biểu hiện của cty hóa chất đều có tài liệu đi kèm.

Cách kiểm tra đơn giản nhất như sau:

1. phá tế bào trong đệm tách (lysis buffer) như cũ, ly tâm thu dịch nổi => được protein tan (soluble total proteins) cái mà em đã làm

2. Giữ cái pellet đấy, rửa nhiều lần bằng các lọai buffer, H2O có thể chứa detergent như SDS, Triton .v.v

3. Resupsend pellet trong lysis buffer có chứa 8M ure, lắc qua đêm ở RT => thu dịch protein tan trong đệm ure => cái này có thể dùng để tinh sạch his-tag ở điều kiện biến tính

4. Vẫn giữ pellet và hòa lại 2x SDS sample loading buffer để điện di SDS-PAGE cùng với các fraction kia kiểm tra

Chúc may mắn,

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em post hình điện di SDS-PAGE lên, các anh xem rồi giúp em với.
Thứ tự các giếng từ 1-14:
Ladder
Control cell
Total protein (mutant 8)
Soluble (mutant 8)
Mutant 8.1 (sử dụng washing buffer có chứa 1%Triton X-100)
Mutant 8.2 (---)
Mutant 8.3 (sử dụng washing buffer có chứa 1M NaCl)
Mutant  8.4 (---)
Total protein (mutant 10)
Soluble (mutant 10)
Mutant 10.1 (sử dụng washing buffer có chứa 1%Triton X-100)
Mutant 10.2 (---)
Mutant 10.3 (sử dụng washing buffer có chứa 1M NaCl)
Mutant10.4 (---)

Thành phần binding buffer và elution buffer như cũ, em chỉ thay đổi thành phần washing buffer( thêm 1% Triton hoặc tăng nồng độ NaCl lên 1M).

Anh Hưng có viết là:

Với trường hợp 2 bạn thay đổi các nồng độ immidazole, thêm beta-mecaptoethanol, ethanol, triton... vào washing buffer xem sao.

về Triton thì em biết tác dụng,nhưng em không hiểu tại sao anh bảo là thêm beta-ME vào washing buffer. Ý em là tác dụng của beta-ME là phá vỡ cầu nối disulfide (theo như em biết là như vậy) nên em nghĩ trong trưong72 hợp này thêm beta-ME vào không có tác dụng.Em không biết suy nghĩ của em đúng không. Anh chị tư vấn thêm nha.
Em cám ơn .



Sửa lỗi post hình cẩu thả bởi DVC

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

À,quên. Protein của em có MW khoảng 20 KDa (band ở dưới)

 

[Cao Xuân Hiếu]

Em post hình điện di SDS-PAGE lên, các anh xem rồi giúp em với.

Em crop hình lại rồi attach lên thẳng 4rum bằng công cụ gắn file.

Thứ tự các giếng từ 1-14:
Mutant 8.1 (sử dụng washing buffer có chứa 1%Triton X-100)
Mutant 8.2 (---)
Mutant 8.3 (sử dụng washing buffer có chứa 1M NaCl)
Mutant  8.4 (---)
Thành phần binding buffer và elution buffer như cũ, em chỉ thay đổi thành phần washing buffer( thêm 1% Triton hoặc tăng nồng độ NaCl lên 1M).

Không có gì đáng kể xảy ra khi bỏ thêm Triton và NaCl nhỉ. Em thử cắt cái band ở trên rồi đưa lên MALDI, làm MS xem nó là protein của E.coli hay là dimer protein của em. Sau đó sẽ hiểu ý phía dưới.

Anh Hưng có viết là:

Với trường hợp 2 bạn thay đổi các nồng độ immidazole, thêm beta-mecaptoethanol, ethanol, triton... vào washing buffer xem sao.

về Triton thì em biết tác dụng,nhưng em không hiểu tại sao anh bảo là thêm beta-ME vào washing buffer. Ý em là tác dụng của beta-ME là phá vỡ cầu nối disulfide (theo như em biết là như vậy) nên em nghĩ trong trưong72 hợp này thêm beta-ME vào không có tác dụng.Em không biết suy nghĩ của em đúng không. Anh chị tư vấn thêm nha.
Em cám ơn .

==> Em tính thử xem liệu em có thực sự cần tách ở điều kiện nature ko? hay là điều kiện denature với 8M ure cũng được? Quan trọng là yêu cầu sau khi tinh sạch là gì?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em tính thử xem liệu em có thực sự cần tách ở điều kiện nature ko? hay là điều kiện denature với 8M ure cũng được? Quan trọng là yêu cầu sau khi tinh sạch là gì?

Em cần tách ở điều kiện nature vì em làm về affinity giữa ligand với receptor.

 

[Nguyễn Viết Dũng]

Theo mình thì bạn nên khẳng định chính xác thêm một lần nữa xem protein của bạn có phải đã ?biểu hiện dưới dạng ?inclusion body hay không: Bạn cần kiểm tra insoluble fragtion trên gel hoặc quan sát hình thái tế bào cũng được.

Việc hình thành inclusion body ?đã được các anh chị giải thích kỹ rồi, mình chỉ thêm một ý này thôi: Nếu đột biến của bạn có liên quan đến Cysteine thì đôi khi cũng dẫn đến sự hình thành inclusion body vì một thêm vào một hay lấy đi một nhóm -SH đều có thể gây ảnh hưởng đến cấu trúc của bậc 3 của ?protein

Trong trường hợp bạn đã thử hết phương cách mà vẫn chưa khắc phục được khó khăn trên thì bạn hãy thử đổi chủng Ecoli khác xem sao

Chúc bạn thoát khỏi rắc rồi này

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Việc sử dung beta-ME đúng là để phá vỡ cầu nối disulfide. Như tôi đã nói:

Việc có lẫn băng tạp có thể do 2 khả năng

1. Protein tạp cũng chứa his-tag

2. Protein tạp gắn với protein của bạn

Protein tap gắn với protein của bạn có thể do nhiều tương tác khác nhau, trong đó có liên kết thông qua cầu disulfide. Đến đây chắc bạn đã hiểu ý tôi nói.

Trong trường hợp này của bạn, nên thêm triton, ethanol và beta-ME. Sau đó bạn dùng chính protein đã tinh sạch lần 1 (đã cho qua cột lần 1) làm mẫu thử và cho qua cột lần hai. Chắc chắn sẽ có cải thiện lớn.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Hưng,

Protein tap gắn với protein của bạn có thể do nhiều tương tác khác nhau, trong đó có liên kết thông qua cầu disulfide. Đến đây chắc bạn đã hiểu ý tôi nói.

Protein của em không có cys- nên không thể tạo cầu nối disulfide.
Anh Dũng có viết

Theo mình thì bạn nên khẳng định chính xác thêm một lần nữa xem protein của bạn có phải đã ?biểu hiện dưới dạng ?inclusion body hay không: Bạn cần kiểm tra insoluble fragtion trên gel hoặc quan sát hình thái tế bào cũng được.

Em đã xem lại hình điện di, và em nghĩ cũng có thể protein của em đã biểu hiện dưoi71 dạng inclusion body. Em đang nghĩ đến việc tinh sạch protein ở điều kiện biến tính (denature condition) rồi refolding. Không biết có khả thi không đây.
Em cám ơn các anh.

 

[Dương Văn Cường]

Về chuyện refolding, một số anh chị có kinh nghiệm đã nêu ý kiến ở topic này, em tham khảo nhé:

http://sinhhocvietnam.com/vn/modules.php?name=Forums&file=viewtopic&t=283

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Thế anh Cường đã thử khắc phục vấn đề bằng cách nào? Thay đổi điều kiện nuôi cấy hay thy đổi chủng vi khuẩn hay cách khác?

 

[Dương Văn Cường]

Khôn đọc lại bài của anh ở topic đó nhé. Anh không có vấn đề gì, sau khi phá tế bào ly tâm anh thu dịch nổi là OK. Anh đặt câu hỏi là để tìm hiểu thôi. Chính vì không có kinh nghiệm thực nghiệm nên anh không tiếp tục trao đổi với các anh chị ở trong topic đó.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Các anh chị ơi,
Em đã thử thêm vào binding buffer và washing buffer 20% ?Ethanol, 20% Glycerol, dùng tới 1M NaCl và thử giảm pH xuống còn 6.5 nhưng vẫn bị nhiễm protein tạp.Bó tay luôn. Anh chị còn biết cách nào khác hoặc chất nào khác có thể làm giảm tạp protein không?À, em có thử dùng 1% SDS, nhưng em không biết làm sao làm tan SDS trong buffer (em khuấy hoài mà nó không chịu tan, đun lên thì mới tan nhưng khi để trong tủ lạnh thì nó lại trở lại dạng không tan).
Anh chị đã bao giờ sử dụng SDS trong khi tinh sạch protein chưa?
Em cũng đã thử tinh sạch protein từ inclusion body, nhưng không hiều sao khi em bỏ resin vào thì protein của em không thể bám với resin, kết quả là lượng protein thu được rất thấp.(hình điện di có 8 giếng), với tứh tự giếng như sau: Marker-Lysate-Flowthroght-Eluates. Band protein ở flowthrough rất đậm chứng tỏ protein của em đã không thể bám vào resin nên bị trôi đi.
Anh chị giúp em với.