Chạy RAPD lúc được lúc hỏng, nguyên nhân và cách khắc phục?

[Huỳnh Chấn Khôn]

Chạy RAPD lúc được lúc hỏng, nguyên nhân và cá

Em chạy phản ứng RAPD mà lúc ra lúc không. Em không hiểu do nguyên nhân gì nữa. Em nghĩ  là RAPD dễ làm lắm nhưng sao lại như vậy?
Anh chị có tài liệu nào viết về RAPD trouble shooting không?Cho em xin với. Thời gian làm đề tài sắp hết rồi mà em làm hoài không ra. Lo quá.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Không ai chạy RAPD phát nào cũng OK đâu. Em chạy mẫu nhiều ra 1 tí, 1 nửa điện di kiểm tra 1 nửa cất -20°C đến khi nào tất cả các mẫu đều OK thì điện di 1 lượt.

Các mẫu ko lên thì có thể làm 1 trong 3 cách sau tuy độ bẩn của mẫu 1) lắc lại phenol, 2) tủa lại EtOH, 3) thôi lại band DNA genome

Chúc may mắn

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em chạy 25ul mỗi phản ứng, vậy tức là mỗi lần điện di kiểm tra thì em sẽ điện di khoảng 10ul? Anh có nói đến việc lắc lại trong phenol và tủa lại trong EtOh. Em chưa hiểu lắm.Anh có thể chỉ rõ hơn cho em về cách tinh sạch mẫu không?
Em có đọc tài liệu thì người ta có nói là hàm lượng Primer và DNA mẫu phải tương xứng với nhau,Primer không nên nhiều quá ,cũng không nên ít quá.Nhưng cái máy đo OD của lab em nó bị khùng khùng.Em không dám tin vào kết quả đo OD để suy ra lượng DNA. Có cách nào chỉ nhìn hình điện di mà đoán ra được nồng độ DNA mẫu không?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Em chạy 25ul mỗi phản ứng, vậy tức là mỗi lần điện di kiểm tra thì em sẽ điện di khoảng 10ul?

chạy 10ul là đủ rồi. Nếu muốn chắc thì làm pư 30/50ul thì vô tư.

Anh có nói đến việc lắc lại trong phenol và tủa lại trong EtOh. Em chưa hiểu lắm.Anh có thể chỉ rõ hơn cho em về cách tinh sạch mẫu không?

thực ra là lặp lại các bước trong quá trình tinh sạch DNA. Nếu lo DNA lẫn protein thì lặp lại từ bước lắc phenol. Nếu sợ mẫu DNA còn các muối linh tinh thì tủa lại EthOH. Nếu sợ DNA bị gẫy vụn nhiều quá thì cắt band DNA genome rồi tinh sạch lại.

Em có đọc tài liệu thì người ta có nói là hàm lượng Primer và DNA mẫu phải tương xứng với nhau,Primer không nên nhiều quá ,cũng không nên ít quá.Nhưng cái máy đo OD của lab em nó bị khùng khùng.Em không dám tin vào kết quả đo OD để suy ra lượng DNA. Có cách nào chỉ nhìn hình điện di mà đoán ra được nồng độ DNA mẫu không?

Để xác định nồng độ DNA chỉ bằng điện di thì có thể dùng các DNA mass ladder nghĩa là các ladder mà mỗi băng vạch đã biết trước là bao nhiêu ng. Sau đó, chụp ảnh và scan lại rồi dùng phần mềm định lượng peak hoặc bằng mắt thường tùy yêu cầu.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Anh Hiếu ơi,
vậy nếu như nồng độ DNA mẫu sử dụng trong phản ứng là 20ng thì lượng primer em nên sử dụng là bao nhiêu là phù hợp.Bữa tới giờ em cứ sử dụng nồng độ Primer trong mỗi phản ứng là 1microMol mà chẳng cần quan tâm đến nồng độ DNA mẫu. Như vậy là mạo hiểm quá phải không anh Hiếu.Em đọc nhiều bài báo,mỗi bài mỗi khác,có bài thì họ chỉ dùng có 5ng DNA mẫu và 0,4 microMol Primer, có bài thì dùng 20-50ng và primer là 1 microMol primer.
Có nhiều cái em vẫn chưa hiểu lắm,ví dụ như số chu kỳ chạy .Tại sao lúc thì tác giả lại chạy 40 chu kỳ,lúc thì chạy 45 chu kỳ.Nếu như chạy nhiều chu kỳ quá hoặc ít chu kỳ quá thì sẽ không xuất hiện band nào hết đúng không?

 

[Cao Xuân Hiếu]

Khi đọc các bài báo về PCR thì chưa chắc làm theo đúng như họ là mình có kết quả y hệt đâu. Kết quả PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố nên mình cần phải chuẩn hóa theo điều kiện của mình.

Em nên tìm các tài liệu cơ bản về PCR ghi vào sổ tay 1) các giá trị giới hạn 2) chiều tăng / giảm tương ứng với độ đặc hiệu/độ nhạy pư. Ví dụ DNA polymerase nên nằm trong khoảng ?U/ul pư, tăng/giảm DNA polymerase thì sẽ làm sao .v.v.

Đối với PCR trong RAPD thì em cần phải biết kết quả kỳ vọng là gì? Em ko thích khi điện di chỉ lên 1 vạch cả => giảm tính đặc hiệu của pư đi, phải làm sao mà có thể nhìn thấy sự khác biệt về băng vạch giữa các mẫu có nguồn gốc đủ xa nhau. Thông thường em lấy 2 mẫu cách xa nhau nhất rồi cần phải tăng giảm từng yếu tố đề có kết quả PCR sao cho có 1 lượng nhất định băng vạch sai khác. Đó là bước mất nhiều công sức nhất và sau đó chỉ áp dụng 1 đk cho tất cả các mẫu.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em đã từng thay đổi các thành phần trong phản ứng PCR của mình để có thể làm xuất hiện nhiều band hơn và các band đậm hơn. Sau cùng em có được nồng độ các chất mà em nghĩ là tối ưu là:
3 mM MgCl2
0,5U Taq polymerase
0,2 mM dNTPs
1 microMol Primer

Nhưng khi áp dụng các thành phần này để chạy thì chỉ có 1-2 mẫu là ra, còn những mẫu còn lại thì lại không ra.Em nghĩ đáng lý thì những mẫu không ra đó nó cũng phải ra chứ.Em đã làm nhiều lần mà đề bị kết quả như vậy,chẳng biết nguyên nhân là do đâu.

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Em chạy đa số mẫu không ra nghĩa là ko có băng vạch nào cả, hay là chỉ có 1 vài băng hay cụ thể như thế nào?

2. Chu trình nhiệt ntn?

3. Taq DNA polymerase là của hãng nào?

4. Đưa cho anh 1 cái image từ PCR product để xem thế nào.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

sao nhiều Mg thế? Mg nhiều sẽ tạo sản phẩm không đặc hiệu

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

chạy RAPD lúc ra lúc ko

Mẫu không ra là không có band nào cả.

Chu trình nhiệt của em như sau:
94 độ -4 phút
94 - 1 phút
33 - 1 phút
72 - 2 phút
Lặp lại từ bước 2: 40 chu kỳ
72 - 10 phút.

Taq polymerase của em là iTaq, của công ty Bio - rad.

Anh ơi, làm sao post hình lên?em ko biết cách post lên.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Em host cái hình của em ở imageshack: http://imageshack.us/ rồi sau đó cài cái directlink vào câu lệnh

(chọn insert image)

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

ko biết có post dc ko.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Sao em chụp hình "đẹp" quá dzậy? Em phải zoom ?máy chụp hình sát vào các bands điện di; nhìn cái hình của em toàn thấy tứ phía bốn bề còn cái band thì kô thấy đâu.

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Phải miêu tả các giếng là những gì chứ? sao bảo chỉ có 2 mẫu lên còn tất cả k?

2. Em đề nghị các sếp cho người set lại hệ thống chụp ảnh đi. Ảnh chụp thế này thì có khi mẫu lên hay ko lên cũng chẳng biết.

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

Em chụp hình gel bằng máy Geldoc của Bio- Rad. Em nghĩ tại vì em load ít sản phẫm PCR quá nên nó mờ. Cùng làm đề tài này với em còn có 1 bạn nữa, em lấy mẫu ở Bà Rịa, còn nó lấy ở Bình Dương. Nếu em nhớ ko lầm thì tới bây giờ em chỉ làm ra khoảng 4 mẫu. Em có tới 11 giống tiêu lận, nên ít nhất thì em phải ra dc 11 mẫu.

 

[Trần Hoàng Dũng]

Em chụp hình gel bằng máy Geldoc của Bio- Rad. Em nghĩ tại vì em load ít sản phẫm PCR quá nên nó mờ. Cùng làm đề tài này với em còn có 1 bạn nữa, em lấy mẫu ở Bà Rịa, còn nó lấy ở Bình Dương. Nếu em nhớ ko lầm thì tới bây giờ em chỉ làm ra khoảng 4 mẫu. Em có tới 11 giống tiêu lận, nên ít nhất thì em phải ra dc 11 mẫu.

Hình mờ là do kỹ thuật chụp hình của em kém, chứ thật ra nhìn các band rất rõ, chứng tỏ PCR của em cũng kô tồi. Thường lấy 2,5 ul để chạy điện di là ok.

Nhìn hình chụp của em thấy giống hình chụp từ trên ... vệ tinh quá; em phải focus lại, gí ống kính sát cái gel, và chụp phần gel và các bands cho thật rõ, chứ đâu cần cụp cả không gian cái phòng làm việc của em.

 

[Dương Văn Cường]

Thường lấy 2,5 ul để chạy điện di là ok.

Em ở nhà thường lấy tới 4ul, sang bên này thường chỉ lấy 1ul là đẹp.

Nhân tiện nói về điện di. Khi tách plasmid (miniprep) kinh nghiệm của tôi là gộp 2 thể tích vào làm 1 lần. Với 1 ống eppendoft thể tích 1.5 sau khi ly tâm thu pellet thì bỏ dịch nổi đi, cho thêm 1.5ml nữa vào ly tâm tiếp và như vậy lượng DNA thu được sẽ nhiều hơn. Các bước sau làm bình thường.

Một kinh nghiệm nhỏ nữa là khi điện di với mục đích kiểm tra (PCR product, plasmid, RE digestion ...) nên dùng loại giếng nhỏ, loại 8 giếng 1 bản. Dùng giếng nhỏ chỉ cần load mẫu ít, band đẹp, nhìn rõ. Có thể đổ gel dầy hơn để có thể load lượng mẫu nhiều như khi dùng loại to 6 giếng/bản.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Em chụp hình gel bằng máy Geldoc của Bio- Rad. Em nghĩ tại vì em load ít sản phẫm PCR quá nên nó mờ. Cùng làm đề tài này với em còn có 1 bạn nữa, em lấy mẫu ở Bà Rịa, còn nó lấy ở Bình Dương. Nếu em nhớ ko lầm thì tới bây giờ em chỉ làm ra khoảng 4 mẫu. Em có tới 11 giống tiêu lận, nên ít nhất thì em phải ra dc 11 mẫu.

1, Thế RAPD của em dùng bao nhiêu cặp primer?, đoạn sản phẩm có vùng kích thước khoảng bao nhiêu?

2, Em so sánh băng điện di DNA genome của 11 mẫu xem có sự khác biệt gì giữa DNA genome của 4 mẫu lên và các mẫu còn lại k?

 

[Huỳnh Chấn Khôn]

chạy RAPD lúc ra lúc ko, nguyên nhân và cách khắc

Xin lỗi các anh vì lâu quá không gửi trả lời, tại vì mấy tuần vừa rồi em bận đi gác thi đại học với lại lo vụ giấy tờ trong trường nên không làm thí nghiệm được.
Em sử dụng 6 mồi ngẫu nhiên, nhưng mỗi phản ứng RAPD của em thì chỉ sử dụng duy nhất 1 mồi (vì là mồi ngẫu nhiên). Cỏn về kích thước sản phẩm thì em cũng không biết vì nó là sản phẫm ngẫu nhiên, nên ko thể biết trước được.
Có nhiều lúc em lấy lại mẫu mình đã chạy ra, chạy lại cùng điều kiện, primer thì nó ko ra. Em chẳng hiểu nguyên nhân từ đâu. Có người nói là do thao tác mix PCR của em có vấn đề,nhưng em lại ko nghĩ vậy.