Tìm hiểu về các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (Next-generation sequencing)

[Ho Huu Tho]

"Nhu cầu của các công nghệ mang tính cách mạng để có thể phân tích thông tin toàn bộ bộ gen một cách nhanh chóng, kinh tế và chính xác chưa bao giờ lớn như hiện nay. Thách thức này chính là động lực thúc đẩy sự phát triển các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS). Khả năng tạo ra lượng lớn các dữ liệu về trình tự là ưu thế căn bản so với các phương pháp kinh điển...." (Michael L. Metzker, 2010)

Topic này để các bạn đặt câu hỏi, trao đổi về các khía cạnh liên quan đến nguyên lý, ứng dụng và triển vọng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Hy vọng chúng ta sẽ thu được những điều bổ ích từ những thảo luận ở đây.

 

[Ho Huu Tho]

Mình xin mở hàng câu hỏi này, nhờ các bạn cùng trả lời giúp:
Những điểm khác biệt căn bản giữa công nghệ giải trình tự thế hệ mới so với công nghệ giải trình tự kinh điển theo phương pháp Sanger là gì?

 

[voh5]

Cái món này em không hiểu lắm, chỉ có một bài review (chưa kịp đọc - up lên đây luôn cho anh em tham khảo) tải xuống khi có thằng hãng sang làm việc cùng!
Bác Thọ chắc đọc bài review này rồi, giải thích cho anh em luôn đi bác! Riêng em, quan tâm nhiều tới nhu cầu và khả năng cung cấp tại Việt Nam nên gặp một lần rồi ... xếp xó luôn. Nói chung, với khả năng của Việt Nam thì chắc sang thập kỷ tới mới có một cái máy được cung cấp tại Việt Nam.
Thằng hãng (Illumina) mà em gặp, nó có một phần video cho anh em tham khảo qua công nghệ của nó. Em attach luôn cho các anh chị em vào xem có ích gì không nhé.

 

[voh5]

Tiện thể, có luôn bài review của công nghệ Sequencing by synthesis mà thằng Illumina sử dụng, mời anh chị em tham khảo luôn.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Toi cung co 1 bai da viet va 1 bai dang viet do (trong do co tra loi 1 phan cau hoi cua Tho.)

Công nghệ giải mã DNA thế hệ mới dành cho mRNA (2008)

Giải trình gene thế hệ mới (2010: Hoan nghenh moi nguoi tham gia viet cung hoac neu van de ma muon toi de cap den trong bai viet)

 

[Ho Huu Tho]

Những điểm khác biệt căn bản giữa công nghệ giải trình tự thế hệ mới so với công nghệ giải trình tự kinh điển theo phương pháp Sanger là gì?

Toi cung co 1 bai da viet va 1 bai dang viet do (trong do co tra loi 1 phan cau hoi cua Tho.)

Công nghệ giải mã DNA thế hệ mới dành cho mRNA

Giải trình gene thế hệ mới

Cảm ơn những bài viết của anh Hiếu.
Tôi nhặt được ý từ bài viết của anh để so sánh hai loại công nghệ, có gì nhờ anh bổ sung thêm:
- Khác nhau về chiến lược khi ứng dụng để giải trình tự của bộ gen:
Chiến lược áp dụng cho phương pháp Sanger là giải trình tự lần lượt các mảnh ADN liền kề nhau được tạo ra ngẫu nhiên từ bộ gen sau khi chúng được chèn vaò các phân tử trung gian (dòng hóa).
Chiến lược áp dụng cho các công nghệ giải trình tự thế hệ mới là giải trình tự đồng thời tất cả các mảnh ADN ngắn (dưới 40 bp đến khoảng 400bp), được tạo ra ngẫu nhiên từ bộ gen. Những đoạn này được giải trình tự trực tiếp mà không cần phải chèn vào các phân tử trung gian. Tuy nhiên, việc phân tích dữ liệu của tất cả các đoạn ngắn này để thu được trình tự của toàn bộ bộ gen cũng là một trở ngại lớn của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới.

 

[Ho Huu Tho]

- Khác biệt liên quan đến nguyên lý hoạt động:
Phương pháp Sanger: Phản ứng giải trình tự được tiến hành trong dung dịch, mỗi dung dịch phản ứng giải trình tự chỉ có thể đọc trình tự của một đoạn nhất định.
Các công nghệ giải trình tự thế hệ mới: Phản ứng giải trình tự được tiến hành trên bề mặt giá đỡ, mỗi phản ứng được khu trú ở một khu vực nào đó trên bề mặt giá đỡ nên có thể tiến hành đồng thời rất nhiều phản ứng giải trình tự (lên đến hàng triệu phản ứng) trên một giá đỡ.

 

[Cao Xuân Hiếu]

- Khác biệt liên quan đến nguyên lý hoạt động:
Phương pháp Sanger: Phản ứng giải trình tự được tiến hành trong dung dịch, mỗi dung dịch phản ứng giải trình tự chỉ có thể đọc trình tự của một đoạn nhất định.
Các công nghệ giải trình tự thế hệ mới: Phản ứng giải trình tự được tiến hành trên bề mặt giá đỡ, mỗi phản ứng được khu trú ở một khu vực nào đó trên bề mặt giá đỡ nên có thể tiến hành đồng thời rất nhiều phản ứng giải trình tự (lên đến hàng triệu phản ứng) trên một giá đỡ.

Sanger là phản ứng giới hạn chuỗi với các ddNTP gắn huỳnh quanh nghĩa là tạo ra 1 quần thể các chuỗi (từ 1 loại template gốc đồng nhất) sai khác 1 nucleotide

NGS sử dụng các NTP gắn "màu" không làm dừng phản ứng polymeration lại và được "loại màu" qua bước rửa giữa các lần kéo dài

 

[Ho Huu Tho]

NGS sử dụng các NTP gắn "màu" không làm dừng phản ứng polymeration lại và được "loại màu" qua bước rửa giữa các lần kéo dài

Theo tôi được biết, trong số các công nghệ giải trình tự thế hệ mới hiện tại, có hệ thống giải trình tự SOLiD của Life/APG không dùng đến polymerase hay NTP được gắn màu, mà sử dụng enzym ligase và thư viện các probe được gắn màu.
Hệ thống 454 của Roche sử dụng nguyên lý pyrosequencing nên dùng các nucleotid không gắn màu và phản ứng chuỗi không liên tục.

Hệ thống Solexa của hãng Illumina sử dụng các NTP gắn "màu" như anh Hiếu nói, bốn loại A, T, G, C được gắn 4 màu phân biệt nhau. Tuy nhiên, phản ứng chuỗi ở hệ thống này được tiến hành theo từng bước một chứ không liên tục:
​

- Ở mỗi bước, enzym polymerase chỉ gắn thêm được 1 nucleotid duy nhất vì nhóm OH ở vị trí 3' của nucleotid vừa được gắn thêm bị khóa. Vì phản ứng chuỗi dừng lại, nên người ta có thể chụp ảnh để xác định được nucleotid nào vừa được gắn vào.
- Sau mỗi bước, màu gắn vào nucleotid sẽ được loại bỏ để không ảnh hưởng đến quá trình chụp ảnh của các bước tiếp theo, đồng thời nhóm OH ở đầu 3' cũng được mở khóa để enzym polymerase có thể gắn thêm nucleotid tiếp theo.
- Như vậy, mỗi bước sẽ đọc được một nucleotid và quá trình này được lặp đi lặp lại cho đến hết chiều dài của đoạn ADN cần đọc trình tự.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Đúng là tôi đã nói đến Solexa/Illumina khi viết NGS. Cám ơn Thọ đã bổ sung và làm rõ.

 

[Cao Xuân Hiếu]

DiversiLab:
ü Hệ thống giải mã trình tự gene vi sinh vật

ü Sử dụng phương pháp footprinting DNA dựa trên kỹ thuật rep-PCR


Và còn nhiều sản phẩm thông minh độc đáo khác, mọi chi tiết xin vui lòng liên hệ:

cảnh cáo lần cuối cho user hienhien nếu cố tình quảng cáo ko "thông minh" "độc đáo" ở các topic thì các bài viết của bạn sẽ bị xóa, user bị banned.

 

[Ho Huu Tho]

Tại sao khi sử dụng các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (454, Solexa) để re-sequencing bộ gen của người thì chỉ đọc được khoảng hơn 80% trình tự. Những trình tự như thế nào trong bộ gen người thì không đọc được bằng các công nghệ giải trình tự mới hiện tại? Có phải 100% trình tự của bộ gen người đã được công bố trong dự án "Human genome project"?

 

[pththao]

Ở đây cũng có một ý tưởng về sequencing của Dekker:
http://physicsworld.com/cws/article/news/43247
Ý tưởng theo mình hiểu đơn giản là cho mạch đơn DNA đi qua một lỗ hổng và cho đồng thời một dòng ion qua lỗ hổng đó. Do tính chất tĩnh điện của mỗi đơn phân khác nhau nên ảnh hưởng đến cường độ dòng ion qua lỗ hổng là khác nhau. Phân tích biến thiên của dòng ion + thông tin về tốc độ qua lỗ của DNA người ta có thể giải mã trình tự Nu trên mạch đơn đó.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Tại sao khi sử dụng các công nghệ giải trình tự thế hệ mới (454, Solexa) để re-sequencing bộ gen của người thì chỉ đọc được khoảng hơn 80% trình tự. Những trình tự như thế nào trong bộ gen người thì không đọc được bằng các công nghệ giải trình tự mới hiện tại? Có phải 100% trình tự của bộ gen người đã được công bố trong dự án "Human genome project"?

các đoạn lặp lại là vùng khó vượt qua đối với NGS, thậm chí cả khi đã sử dụng pair-end, mate-end library. Vẫn cần những chiến thuật tốt hơn hoặc next next generation sequencing technology.

 

[Ho Huu Tho]

các đoạn lặp lại là vùng khó vượt qua đối với NGS, thậm chí cả khi đã sử dụng pair-end, mate-end library. Vẫn cần những chiến thuật tốt hơn hoặc next next generation sequencing technology.

Bạn Hiếu có thể giải thích giúp hoặc cho đường link trình bày đơn giản về khái niệm của paired-end, mate-pair library được không. Hai cái này khác nhau hay chính là một?

 

[Ho Huu Tho]

Ở đây cũng có một ý tưởng về sequencing của Dekker:
http://physicsworld.com/cws/article/news/43247
Ý tưởng theo mình hiểu đơn giản là cho mạch đơn DNA đi qua một lỗ hổng và cho đồng thời một dòng ion qua lỗ hổng đó. Do tính chất tĩnh điện của mỗi đơn phân khác nhau nên ảnh hưởng đến cường độ dòng ion qua lỗ hổng là khác nhau. Phân tích biến thiên của dòng ion + thông tin về tốc độ qua lỗ của DNA người ta có thể giải mã trình tự Nu trên mạch đơn đó.

Mình mới đọc qua, thấy rất ấn tượng mặc dù chưa hiểu mấy. Hình như phần bạn nêu trong phần in đậm mới chỉ là hy vọng và mong đợi, nhưng chưa thành hiện thực và họ vẫn chưa đọc được trình tự của ADN. Mình nghĩ ngay cả khi họ giải quyết được chỗ mấu chốt này thì chắc vẫn còn nhiều trở ngại khác đang chờ đợi... Tuy nhiên, mình thấy ý tưởng này rất đặc biệt ở chỗ quá trình đọc trình tự khá "thuần túy vật lý", không bị phụ thuộc vào các enzym (enzym đòi hỏi yêu cầu đặc biệt về nhiệt độ, đệm, cơ chất, ...). Nếu ý tưởng này thành hiện thực chắc sẽ có read length dài và "vượt qua" được những trình tự khó đối với các công nghệ giải trình tự thế hệ mới hiện tại.
Mình có thắc mắc là ở đây lực nào khiến phân tử ADN di chuyển qua lỗ hổng và ADN sẽ di chuyển qua lỗ hổng theo chiều nhất định của phân tử ADN (5'-->3' hoặc ngược lại) không?

 

[pththao]

Mình mới đọc qua, thấy rất ấn tượng mặc dù chưa hiểu mấy. Hình như phần bạn nêu trong phần in đậm mới chỉ là hy vọng và mong đợi, nhưng chưa thành hiện thực và họ vẫn chưa đọc được trình tự của ADN. Mình nghĩ ngay cả khi họ giải quyết được chỗ mấu chốt này thì chắc vẫn còn nhiều trở ngại khác đang chờ đợi... Tuy nhiên, mình thấy ý tưởng này rất đặc biệt ở chỗ quá trình đọc trình tự khá "thuần túy vật lý", không bị phụ thuộc vào các enzym (enzym đòi hỏi yêu cầu đặc biệt về nhiệt độ, đệm, cơ chất, ...). Nếu ý tưởng này thành hiện thực chắc sẽ có read length dài và "vượt qua" được những trình tự khó đối với các công nghệ giải trình tự thế hệ mới hiện tại.
Mình có thắc mắc là ở đây lực nào khiến phân tử ADN di chuyển qua lỗ hổng và ADN sẽ di chuyển qua lỗ hổng theo chiều nhất định của phân tử ADN (5'-->3' hoặc ngược lại) không?

Đúng rồi, chỉ mới là ý tưởng thôi, do tính phổ biến và mong đợi có thể đẩy nhanh tốc độ nó được coi là ứng cử cho kỹ thuật giải mã nhanh (hình như có giải thưởng gì đó cho việc này.)
Về câu hỏi của Thọ, mình cũng chỉ đọc ý tưởng và không tìm hiểu sâu, tuy nhiên trên nano letter viết như sau (chỉ một dòng đó và không có citation)
"LDouble-stranded DNA (dsDNA) can be driven electrophoretically through the nanopore and detected by monitoring the ion current."
Cụ thể electrophoretically ở đây thế nào mình không được biết. Tuy nhiên việc phân biệt chiều chuyển động theo mình không có khăn lắm, hoàn toàn có thể "mồi" một đầu bằng điện tích và đầu kia bằng điện ngược dấu để có hấp dẫn về hai phía khác nhau (cái này mình nghĩ ra, không cite từ bài báo )

 

[Ho Huu Tho]

Đúng rồi, chỉ mới là ý tưởng thôi, do tính phổ biến và mong đợi có thể đẩy nhanh tốc độ nó được coi là ứng cử cho kỹ thuật giải mã nhanh (hình như có giải thưởng gì đó cho việc này.)

Giải thưởng là 10 triệu USD cho nhóm nào có thể đọc trình tự của 100 genome trong 10 ngày: http://genomics.xprize.org/

 

[Dương Văn Cường]

Pyrosequencing ngoài việc xác định trình tự còn làm được 1 việc khá hay là DNA methylation profiling. Em cũng mới ngốn hơn nghìn bảng mua hóa chất của nó. Buffer nó cũng bán mới đau . Biotin labeled primer thì đắt gấp khoảng 10 lần non labled. Bọn nó độc quyền từ công nghệ, soft, beads, enzyme... cho đến cả buffer thì người nông dân phải làm gì hả các bác?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Người nông dân tiếp tục đi cày lấy tiền nộp cho 322