Điện di thế nào để tách hai band quá gần nhau trên SDS-PAGE?

[Ho Huu Tho]

Mình có vấn đề này xin mọi người giúp:
Sau khi làm Western Blot mình thu được 2 band, một band rất đậm ở 17 KDa (không đúng kích thước như tính toán) và một band mờ hơn nhiều ở 21 KDa (đúng kích thước như tính toán).
Vấn đề là khi band 21 KDa xuất hiện thì band 17 KDa lại quá đậm và hai band không hoàn toàn tách biệt nhau nên khó khăn trong việc phân tích. (Ảnh gel trong hình đính kèm)
Mình muốn hai band này tách xa nhau hơn để tín hiệu của hai band không bị chồng lên nhau, nhưng chưa biết phải làm thế nào. Các bạn có gợi ý nào thì giúp mình với nhé.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Anh Thọ cần cho biết anh điện di với nồng độ gel là bao nhiêu. Thường để phân tách tốt hơn có thể dùng gradient gel (tốt nhất là mua precasting gel ý).

 

[Ho Huu Tho]

Nồng độ gel PAA mình sử dụng là 12%, mình cũng đã thử chạy với nồng độ 15% nữa nhưng chẳng cải thiện được gì.
Gel gradient mà Hưng nói tới có phải là nồng độ của gel thay đổi theo chiều điện di không?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Thế thì có vẻ giống protein degradation nhỉ.
Nếu thằng 17 không đúng thì cho nó chạy ra khỏi gel luôn đi
Invitrogen prestained ladder có băng 17kDal, chờ nó chạy ra khỏi gel là tắt nguồn lấy gel đem làm Western
Cách nhau có 4 kDal, nói chung rất khó. Vấn đề nữa là cái band 17 lại quá đậm.
Chứ 2 thằng này dù có làm cách gì cũng không thể tách quá xa nhau được.
Thử Tricine-SDS-PAGE xem.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Nồng độ gel PAA mình sử dụng là 12%, mình cũng đã thử chạy với nồng độ 15% nữa nhưng chẳng cải thiện được gì.
Gel gradient mà Hưng nói tới có phải là nồng độ của gel thay đổi theo chiều điện di không?

Gradient gel là gel có nồng độ thay đổi theo chiều dọc của bản gel, cái này ai làm DGGE thì biết. Trong trường hợp của bác chạy gel 12% tốt hơn 15%. Dùng Gradient gel 8%-16% sẽ tốt hơn nữa. Bác xem độ phân tách của các protein ứng với các gel khác nhau ở đây: http://www3.bio-rad.com/cmc_upload/Products/-26832/Crit_Tris-HCl_Mgchart.gif

Nói chung còn tùy mục đích làm Immunoblot, chứ em thấy có 2 bands như thế vẫn publish được không sao. Với lại trong 2 bands của bác thì cái nào là unspecific band? Và bác có thể nêu cụ thể thí nghiệm ra đây để tìm cách giải quyết không?

 

[Ho Huu Tho]

Thế thì có vẻ giống protein degradation nhỉ.
Nếu thằng 17 không đúng thì cho nó chạy ra khỏi gel luôn đi
Invitrogen prestained ladder có băng 17kDal, chờ nó chạy ra khỏi gel là tắt nguồn lấy gel đem làm Western

Band ở 17 KDa không đúng như tính toán thôi, chứ hiện tại thì em vẫn phải xác định xem nó là cái gì nữa bác Lương ạ. Dù sao em cũng sẽ đề xuất cách này, có khi ông thầy lại thích.

Gradient gel là gel có nồng độ thay đổi theo chiều dọc của bản gel, cái này ai làm DGGE thì biết. Trong trường hợp của bác chạy gel 12% tốt hơn 15%. Dùng Gradient gel 8%-16% sẽ tốt hơn nữa.

Mình dự định sẽ đổ một gel có hai nồng độ như sau theo gợi ý của bạn Hưng: nửa dưới có nồng độ 6% và nửa trên có nồng độ 15%, để kiểm tra xem nó có phân tách hai band ở trên tốt hơn không?
Để chuẩn bị gel như ở trên, liệu mình có thể thao tác như sau được không: đổ nửa gel 6% ở dưới, chờ đông nửa dưới rồi đổ tiếp nửa trên 15%, và cuối cùng là đổ lớp gel cô trên cùng. Lúc lấy gel ra để chuyển màng liệu hai nửa 6% và 15% này có dính vào nhau nữa không nhỉ?

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Mình dự định sẽ đổ một gel có hai nồng độ như sau theo gợi ý của bạn Hưng: nửa dưới có nồng độ 6% và nửa trên có nồng độ 15%, để kiểm tra xem nó có phân tách hai band ở trên tốt hơn không?
Để chuẩn bị gel như ở trên, liệu mình có thể thao tác như sau được không: đổ nửa gel 6% ở dưới, chờ đông nửa dưới rồi đổ tiếp nửa trên 15%, và cuối cùng là đổ lớp gel cô trên cùng. Lúc lấy gel ra để chuyển màng liệu hai nửa 6% và 15% này có dính vào nhau nữa không nhỉ?

Bác ơi Gradient không có nghĩa như vậy ạ. Gradient 8%-16% tức là nồng độ thay đổi dần đều từ 8% đến 16% chứ không phải một nửa 8%, 1 nửa 16%. Bình thường các bác chạy DGGE phải đổ cái gel gradient bằng tay, thì có cái thiết bị để trộn rồi đổ gel vào bản gel theo tỷ lệ thay đổi dần đều sao cho tạo ra gradient gel theo thiết kế. Còn bình thường không có thiết bị đấy thì không tự đổ gel gradient được. Tốt nhất là mua của hãng.

 

[Ho Huu Tho]

Bác ơi Gradient không có nghĩa như vậy ạ. Gradient 8%-16% tức là nồng độ thay đổi dần đều từ 8% đến 16% chứ không phải một nửa 8%, 1 nửa 16%. Bình thường các bác chạy DGGE phải đổ cái gel gradient bằng tay, thì có cái thiết bị để trộn rồi đổ gel vào bản gel theo tỷ lệ thay đổi dần đều sao cho tạo ra gradient gel theo thiết kế. Còn bình thường không có thiết bị đấy thì không tự đổ gel gradient được. Tốt nhất là mua của hãng.

Cảm ơn Hưng giải thích tường tận. Mình chưa có điều kiện để mua của hãng và cũng chưa có dụng cụ đổ gel gradient. Nhưng mình thấy ý tưởng gia tăng sự phân tách hai band quá gần nhau nhờ gel gradient rất hay nên muốn vận dụng theo điều kiện hiện có.
Theo mình nghĩ thì gel có hai nửa với hai nồng độ khác nhau là trường hợp đặc biệt của gel gradient nên về mặt nguyên lý thì nó vẫn có thể áp dụng để phân tách hai band trong thí nghiệm của mình (mặc dù có thể không phải là gel gradient tối ưu).
Tuy nhiên, mình chưa chuẩn bị gel như vậy bao giờ nên không biết nên thực hiện các bước thế nào.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Co 3 cach

1. Dung precast gradient gel nhu Hung da noi.

2. Thay doi buffer va % Acrylamid. No co 1 bang tong hop su to hop cua 2 yeu to nay va vung phan tach toi uu o dau do tren internet (nhu Anh Luong noi)

3. Chay tren ban gel dai voi Voltage nho (chay qua dem)