Can we do better than Agobacterium?

[Nguyễn Phương Thảo]

Hì hục viết 1 bài dài ngoằng xong bấm nhầm thế nào xóa mất sạch :x . Thôi đành xí chỗ ở đây để đêm nay quyết tâm ngồi viết lại. Bài này tôi tổng hợp từ 1 số publications trên Nature và Nature Biotecnology 2005 + private talk với ông trưởng nhóm nghiên cứu này ở CAMBIA về ứng dụng các loài vi khuẩn khác trong chuyển gen ở thực vật.

 

[Dương Văn Cường]

Tiếc nhỉ.

Cũng giống như khi soạn thảo trên word thi thoảng phải Ctrl + S một cái thì ở đây nếu viết bài dải, nhiều công sức thì thi thoảng phải bấm nút copy 1 cái. Sau khi bấm nút đó sẽ có cái popup báo là bài đã được copy vào clibboard. Nếu có vấn đề gì chỉ cần paste lại là xong. Thao tác nhỏ nhưng rất có ích, mọi người nên để ý áp dụng.

Thanks chị Thảo và chờ bài của chị!

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Re: reply

Em cũng có khi đánh máy xong lại vô tình làm mất.
Trước khi quyết định đánh máy lại toàn bộ, chị có thể vào temporary file lục lại xem (do Office của MS tự động save mỗi 5 phút). Thường thì đất dành cho những file tạm thời này không nhiều nên chị phải lục lại càng sớm càng tốt, không thì nó sẽ bị xóa để chép chồng lên.

Chị mù IT em ạ , thôi ngồi viết lại vậy. 2 hôm vừa rồi hôm thì bia+sake, hôm thì tequila  giờ chả còn nhớ gì, lại phải ngồi nghĩ từ đầu, tệ thế.

SHVN không cho phép đặt tiêu đề bài viết dài nhỉ? Trước đó tôi định đặt tên bài là: New "open source" options for gene tranfer to plants using diverse species of bacteria: Can we do better than Agobacterium?

Các phương pháp để đưa gene mới vào tế bào thực vật có thể chia làm 2 loại: phương pháp vật lý như bắn gen hay electroporation và phương pháp tự nhiên, sử dụng Agrobaterium. Phát kiến về việc Agrobaterium tumefaciens có khả năng chuyển gene vào thực vật đã biến loài này trở thành 1 trong những công cụ quan trong nhất của Công nghệ sinh học thực vật.

Agrobaterium tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gene của mình vào thực vật và sau đó sử dụng bộ máy thực vật để biểu hiện các gene này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. Agro sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây-crown gall disease).

Thập kỷ 70 là thời gian của hàng loạt nghiên cứu quan trọng về Agrobaterium tumefaciens, tạo cơ sở cho phát minh về chuyển gene thực vật sau này. Người ta phát hiện ra bộ gene của các tế bào khối u ở thực vật có gắn 1 đoạn DNA từ vi khuẩn. Hơn thế, các DNA được chuyển vào tế bào thực vật này (gọi là T-DNA: tranferred DNA) là 1 phần của 1 phân tử DNA nhỏ nằm ngoài NST của vi khuẩn. Phân tử DNA vi khuẩn này được gọi là Ti (tumor-inducing) plasmid (1,2). Thực vật bị thương sẽ ứa ra các hợp chất phenol, kích thích sự biểu hiện của các vir-gene (virulence gene) nằm trên Ti-plasmid (3).Vir gene mã hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T-DNA vào genome thực vật. 1 số gene nằm trên vùng T-DNA có khả năng điều khiển sự tổng hợp các hormone sinh trưởng như auxin, cytokinin và phytohormones, dẫn đến sự phân bào nhanh chóng ở các tế bào chuyển gene (4), đây chính là lý do tế bào phát triển thành khối u (hay nốt sần).

Đầu thập kỷ 80 có thể coi là "thời đại hoàng kim" của chuyển gen bằng Agro khi người ta phát hiện ra rằng:
- T-DNA, 1 đoạn của Ti plasmid, sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u này sau đó không phụ thuộc vào sự có mặt của agrobacteria nữa.
- T-DNA được xác định bởi 2 đầu khoảng 25 bp gọi là giới hạn (T-DNA borders), phần còn lại ngoài giới hạn sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gene. Nhờ vậy, có thể loại bỏ khả năng gây hại của T-DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu giới hạn bằng các gene mong muốn. Khi các oncogene bị loại bỏ, tế bào hoặc mô thực vật chuyển gene sẽ phát triển bình thường và trong hầu hết các trường hợp, cho cây hữu thụ (5,6).
- Các nghiên cứu về việc vận chuyển T-DNA vào tế bào thực vật trở nên dễ dàng hơn nhiều nhờ việc sử dụng các marker có thể chọn lọc và kiểm tra được cho quá trình xác định tế bào chuyển gen.

Các nghiên cứu về Agro và khả năng tự nhiên của chúng trong việc biến đổi vật chất sinh học của các tế bào thực vật bị nhiễm đã giúp các nhà khoa học thiết kế được những phân tử giúp chuyển gene mong muốn vào tế bào thực vật. Các phân tử DNA kỹ thuật di truyền này được gọi chung là các vector. 1 hệ thống chuyển gen bằng Agrobacterium thuờng bao gồm:
- 1 chủng Agro mang vùng vir và 1 T-DNA có chứa gen muốn chuyển. Vùng vir và T-DNA có thể nằm trên cùng 1 vector hoặc trên các vector riêng biệt.
- T-DNA được chuyển vào tế bào hoặc mô thực vật và sau đó được gắn vào genome thực vật.
- Gene chuyển biểu hiện trong tế bào thực vật.
- Các tế bào hoặc mô chuyển gene tái sinh thành cây hoàn chỉnh.

Agrobacterium vẫn được coi là giống vi khuẩn duy nhất có khả năng chuyển gene vào thực vật cho tới khi công trình của Broothaerts và cộng sự được công bố trên Nature tháng 2 năm 2005 (7). Trong thời gian làm việc tại Viện CNSH, công việc hàng ngày của tôi là chuyển gen, chuyển gen và chuyển gen .Thêm nữa hầu hết các vector sử dụng đều của CAMBIA (Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture), vì vậy khỏi phải nói tôi đã hứng thú thế nào khi có cơ hội tham dự buổi seminar của Richard A. Jefferson, trưởng nhóm nghiên cứu trên của CAMBIA, hỏi han và trao đổi thêm với ông những ngày sau đó.

Trước đây, người ta đã từng chuyển Ti-plasmid vào các vi khuẩn khác để xem thử nó có khả năng tạo khối u hay không. Khi được đưa vào E. Coli hay Pseudomonas aeruginosa, Ti-plasmid không có khả năng tạo khối u ở thực vật, nhưng khi được chuyển vào các vi khuẩn có quan hệ rất gần với Agro như họ Rhizobiaceae, Ti-plasmid vẫn mang khả năng này (8 ). Tương tự như các kết quả đó, hệ thống chuyển gene nhờ vi khuẩn hoạt động tốt nhất khi sử dụng các vi khuẩn gần gũi với Agrobaterium.

Nhóm tác giả đã tạo ra được 1 hệ thống chuyển gen ổn định cho 3 loài thực vật: thuốc lá, lúa và Arabidopsis khi sử dụng 3 chủng vi khuẩn thuộc 2 họ, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti và Mesorhizobium loti. Họ thu được rất nhiều cây thuốc lá, 1 cây lúa và 1 vài cây Arabidopsis thaliana chuyển gene. Kỹ thuật lai Southern cho thấy T-DNA đã được gắn vào genome cây thuốc lá khi sử dụng cả 3 chủng, A.thaliana và lúa khi sử dụng  Sinorhizobium. Các cây này có chứa 1-3 bản sao T-DNA và các phân tích ở thế hệ sau cho thấy sự di truyền ổn định của gene GUS và kiểu hình kháng hygromycin. Để chứng tỏ rằng việc chuyển gene không phải do bị nhiễm tế bào Agro (họ chuyển gen cả bằng Agro để so sánh), các thí nghiệm đối chứng đã được thiết lập bao gồm: PCR đặc hiệu loài và sử dụng vector thứ cấp (tagged binary vector) (unpublished data). Còn hiệu quả của hệ thống chuyển gene này ra sao? Dựa trên số lượng các điểm b-glucuronidase dương tính, hiệu suất chuyển gene bằng các vi khuẩn khác ở thuốc lá khoảng 10-30% (so với 95-100% khi sử dụng Agro), 0.6% ở lúa (so với 50-80% khi sử dụng Agro), và ở A. thaliana, bằng 1/10 hiệu suất chuyển gen nhờ Agro với cùng quy trình. Tuy nhiên, hiệu suất chuyển gen này có thể được cải thiện bằng việc phối hợp các chủng vi khuẩn và loài thực vật  hay loại tế bào sao cho phù hợp cũng như hiệu chỉnh điều kiện nuôi cấy. Ví dụ, hiệu suất này được cải thiện rõ rệt ở lúa khi thay đổi môi trường ủ, ở thuốc lá khi thay đổi tuổi mô và ở Arabidopsis khi thay đổi môi trường ngâm để nhiễm hoa với Sinorhizobium.

Vậy ý nghĩa của công trình này là gì? Nhiều loại cây lương thực quan trọng rất khó chuyển gene bằng Agrobaterium, khó tái sinh từ những mô mẫn cảm hoặc dễ bị thay đổi kiểu hình và di truyền khi sử dụng hệ thống chuyển gene này. Chuyển gene bằng Agrobacterium vào thực vật đòi hỏi rất nhiều giấy tờ, chứng chỉ phức tạp và hiện vẫn đang bị hạn chế ở rất nhiều nước. Lý do chính là Agro vẫn bị coi là nguồn bệnh (pathogen) thực vật do đặc tính bám và lây nhiễm rất mạnh của nó. Agro gây ra các phản ứng nhiễm bệnh điển hình ở thực vật, gây stress, chết hoại và các hậu quả di truyền khác cho cây. Trong khi đó, các vi khuẩn khác ở thực vật, bao gồm cả Sinorhizobium, Rhizobium và Mesorhizobium tương tác với các loại tế bào khác nhau, ở các thời kỳ khác nhau, như những sinh vật cộng sinh hay biểu sinh lành tính có thể gây ra các phản ứng khác nhau ở thực vật. Nhờ vậy, chúng ta có thể dựa trên các kiểu tương tác đa dạng khác nhau mà tìm ra phương pháp chuyển gene thích hợp hơn cho các loài, các mô hay các loại tế bào thực vật khó chuyển gene. Và hơn hết, trái ngược với những đòi hỏi ngày càng phức tạp phức tạp về việc cấp phép, bản quyền... khi sử hệ thống chuyển gene bằng Agrobacterium, rào cản lớn cho việc cộng tác nghiên cứu hay cho việc thương mại hóa các sản phẩm tạo ra nhờ nghiên cứu chuyển gene, công nghệ mới này được các nhà khoa học ở CAMBIA cung cấp hoàn toàn miễn phí dưới dạng nguồn mở tại http://www.bios.net (9).

Tuy nhiên, công trình nghiên cứu này vẫn còn những tồn tại cần xem xét và giải quyết. Như Mary-Dell Chilton đã phân tích trên Nature Biotechnology số tháng 3 năm 2005 (10): Về mặt ứng dụng, việc khai thác các vi khuẩn này trong dự án thực tế cho những loài cây lương thực khó chuyển gene dường như không khả thi khi mà ở 2 loài cây 2 lá mầm "dễ"  chuyển nhất (thuốc lá và A.thaliana) và loài cây 1 lá mầm dễ nhất (lúa), hiệu suất chuyển gene vẫn thấp hơn đáng kể so với sử dụng Agrobaterium. Chủng vi khuẩn hoạt động hiệu quả nhất Rhizobium lại rất gần với Agrobaterium như lời các tác giả thừa nhận. Điều này khiến người ta đặt ra câu hỏi liệu chủng này có thật sự khác biệt với Agro, đặc biệt là khi vẫn còn đang tranh cãi về mặt phân loại của những thuật ngữ này. Do vậy, dường như có vẻ "an toàn" hơn nếu tập trung nghiên cứu vào Sinorhizobium và Mesorhizobium, cố gắng cải tạo hiệu suất chuyển gen vốn còn thấp của chúng.


References:

1. Zaenen, I. et al. J. Mol. Biol.  86, 109-127 (1974).

2. Chilton, M.D. et al. Cell 11, 263-271 (1977).

3. Wullems, G.J. et al. Cell 24, 719-727 (1981).

4. Hoekema, A. et al. J. Bacteriol. 158, 383-385 (1984).

5. Zambryski, P. et al. J. Mol. Appl. Genet. 1, 361-370 (1982).

6. Zambryski, P. et al. Cell 56, 193-201 (1989).

7. Broothaerts, W. et al. Nature 433, 629-633 (2005).

8. Hooykass, P.J.J. & Schilperoort, R.A. Plant Mol. Biol. 19, 15-38 (1992).

9. Dennis, C. Nature 431, 494 (2004).

10. Chilton, M.D. Nature Biotech. 23, 309-310 (2005).

 

[Dương Văn Cường]

Xin hỏi chị Thảo 1 câu:

- Mình có thể điều khiển cho gene ngoại lai gắn vào vùng nào / NST nào của thực vật (vật chủ) hay không?

- Nếu có thì bằng cách nào? Các chi tiết về vector designing, reading frame, operator ...

- Các ưu điểm của việc này? Liệu có thực sự cần thiết phải biết được là gene ngoại lai được gắn vào đâu trong genome khổng lồ của vật chủ?

- Bản thân chị đã có kinh nghiệm này hay chưa? Thành công hay thất bại?


Sở dĩ em hỏi câu này vì từ trước tới giờ đọc các tài liệu về chuyển gene thực/động vật đều chỉ nói chung chung là gene đưa vào sẽ gắn vào genome vật chủ theo cơ chế trao đổi chéo. Em nghĩ rằng việc đưa gene ngoại lai vào mà không điều khiển được sự biểu hiện của nó thì hiệu quả sẽ giảm nhiều. Ví dụ gene mã hóa cho chất A nào đó có tác dụng làm cho quả cà chua phát quang (ví dụ he he ), nhưng chẳng may gene A lại gắn vào vùng NST chỉ active khi cây còn non (chưa đến tuổi sinh trưởng) thì việc chuyển gene sẽ chẳng có tác dụng gì.

 

[Nguyễn Phương Thảo]

Xin hỏi chị Thảo 1 câu:

- Mình có thể điều khiển cho gene ngoại lai gắn vào vùng nào / NST nào của thực vật (vật chủ) hay không?

- Nếu có thì bằng cách nào? Các chi tiết về vector designing, reading frame, operator ...

- Các ưu điểm của việc này? Liệu có thực sự cần thiết phải biết được là gene ngoại lai được gắn vào đâu trong genome khổng lồ của vật chủ?

- Bản thân chị đã có kinh nghiệm này hay chưa? Thành công hay thất bại?

Như Hoàng đã nói, người ta có thể điều khiển biểu hiện của gen chuyển (cụ thể là biểu hiện bộ phận nào của thực vật: thân rễ, lá, quả....) thông qua các promoter khác nhau.

Có thể điều khiển gen ngoại lai gắn vào 1 vùng xác định trên NST thực vật chủ hay không? Có tuy rất khó, thực tế người ta đã làm được điều này ở lúa và Arabidopsis (2 loài đã xác định được trình tự genome).

Chị đã có kinh nghiệm này chưa? Chưa, chị chưa bao giờ thử và có thử chắc chắn cũng không thành công .

Cách đây khoảng 2 năm, công trình về đề tài này đã được công bố trên Nature Biotechnology hay Nature Genetics gì đó, lâu rồi nên chị không chắc. Muốn điều khiển được vị trí gắn của gene chuyển trên NST cây chủ, người ta phải knock out gene trên NST (gene của thực vật) tại vị trí muốn gắn bằng cách thiết kế 1 trình tự nu giống trình tự nu của 2 đầu gene này vào 2 đầu T-DNA (sát với borders nhưng vẫn nằm trong border). Như vậy 2 đoạn nu trên gene của NST và trên T-DNA sẽ cross over, kết quả là có được T-DNA gắn vào vị trí xác định và gene của NST tại vị trí đó bị knocked out, Tuy nhiên hiệu suất thành công rất thấp. Để có 1 cá thể như vậy phải thu được hàng chục ngàn cây chuyển gene