Thí nghiệm như ma làm

[cfareast]

Bạn Hồng Nhung:

Nếu như Bạn không quen làm "screening" như Bạn Lương chỉ dẫn thì nếu phòng thí nghiệm của Bạn có điều kiện thì Bạn nên dùng phương pháp colony-PCR: rất nhanh (không cần phải chuẩn bị overnight cultures), có thể "screen" được rất nhiều colony cùng một lúc, và có thể biết được kích thước của inserts khá chính xác.

Chúc thành công,

Các bác cứ làm phức tạp thêm. Cứ theo truyền thống mà làm. PCR colony thì tốn kém, và nếu có band đúng, thì vẫn lại phải tách plasmid, cắt kiểm tra lại cho sure.. Vì ai mà biết được cái insert của mình nó nằm ở đâu trong plasmid hay nó lại dính vào genome của host, hay plasmid có bị cụt hay thay đổi gì kích thước không?

Một sáng, bạn có thể tách plasmid của 100 clones riêng. Chọn 5-10 clones tách, thì quá nhanh.

Mẹo làm tắt là nuôi tế bào trong eppendof 1,5ml thôi. Dùng ly tâm luôn...rất tiện. Tuy ít tế bào, nhưng đủ để tách plasmid thoải mái. Tất cả thao tác cũng phải optimize để cho nhanh và ko bị mỏi tay, ví dụ như hút dịch, thì tay đừng có đưa pipet biên độ rộng quá, vừa lâu vừa mỏi. Các protocol đều yêu cầu ly tâm tế bào 5-10 phút (chỉ cần 1-2 phút cũng được) thời gian ủ l(sol I, II, III) có thể rút ngắn, ly tâm 10 phút, thì rút còn 5 phút, rửa cồn 70oC thì có thể bỏ hẳn...

Chạy điện di, khi trộn loading dye thì cứ áng chừng mà lấy (biết cữ pipet 2, 5ul...)...ko nhất thiết cứ phải đúng tỉ lệ, ko cần cứ phải vặn đúng pipet số ul...

NÓi chung làm SHPT vừa làm vừa rút kinh nghiệm và modify.

(Bác nào có kit tách plasmid... thì cứ dùng đi , dùng lại cũng được, miễn là sau khi dùng, rửa sạch (h20 và ethanol sau đó).

 

[Biologist]

one-step miniprep của anh là như thế này đúng không:
+ lấy khoảng 400 ul dịch nuôi
+ ly tâm 2 phút top-speed thu tế bào
+ Cho 20 ul PCI và 40 ul 6xloading buffer vào
+ Vortex 1 phút
+ Ly tâm 10 phút
+ Hút 10 ul dịch nổi đem điện di để quan sát nồng độ plasmid của bạn.
Mục đích theo em hiểu là tách plasmid nhanh nhằm xem kích thước bao nhiêu (hoặc đem so sánh với plasmid gốc), chọn ra clone nghi là đã chèn gene. Nhưng khi chưa cắt thì xác định kích thước dựa vào Marker ladder thì không được, mà để làm các bước tiếp theo như cắt bằng enzyme, PCR thì lại vẫn phải nuôi lại tách lại.
Còn PCI là gì ạ, thành phần thế nào?
Với cả hơi tốn loading buffer nữa, k biết cái này có rẻ k

Bạn Hồng Nhung:

Để tiết kiệm, Bạn có thể tự pha loading buffer. Tuy vậy, Bạn hãy xin ý kiến của advisor xem advisor suy nghĩ thế nào. Vì Tôi làm việc cho biotech industry đã lâu, cách suy nghĩ của Tôi đôi khi cũng khác với các giáo sư ở Việt nam.

Tôi rất đồng ý với Bạn cfareast là một thí nghiệm viên cấp thấp có thể làm 100 plasmid minipreps trong một buổi sáng một cách dễ dàng. Thật ra, khi còn là một PhD student (cách đây 20 năm), Tôi đã thường phải sử dụng multichannel pipettes để làm 300-400 minipreps trong vòng 2-3 tiếng đồng hồ.

Tuy vậy, làm thí nghiệm như thế nào để có hiệu quả nhất và ít tốn kém nhất thì cũng còn tùy trường hợp. Điều này còn tùy theo Bạn nghĩ giá trị của một giờ lao động của một sinh viên hoặc một scientist là 0.20 USD/giờ, 20 USD/giờ, 200 USD/giờ, hay là 800 US/giờ. Hiện nay tại nhiều phòng thí nghiệm của các biotech companies ở Mỹ, nếu một scientist bỏ ra cả một buổi sáng chỉ làm minipreps với hy vọng là sẽ "clone" được một DNA fragment thì có lẽ sẽ bị mất việc sớm.

Chúc thành công,

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Đúng là tách plasmid cổ điển thì rất mệt. Em mới chỉ làm hai lần, mỗi lần 10 cái mà đã mất kiên nhẫn, cho luôn hai cái đĩa petri chi chít khuẩn lạc vào thanh trùng rồi, giờ lại thấy tiếc. Nhưng vẫn phải dùng kiểu cổ điển, với cái pipet đơn thôi. Em sẽ hỏi ý kiến thầy hướng dẫn về minipreps và PCR xem sao. Và vẫn phải xem lại khâu digest plasmid nữa, có nên vừa cắt vừa mix nhẹ (khoảng 300 rpm) không nhỉ, tại plasmid không hiểu sao cắt không hoàn toàn. Và khi cắt xong điện di mỗi lần một khác, lúc thì hai band tách ra, lúc thì một band. Không sao biết được nó ở trạng thái gì nữa

 

[cfareast]

Bạn làm mất thời gian và ko hiệu quả.
Tách plasmid mini chắc bị bẩn hay làm sai khâu nào đó.

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Clony-PCR gặp phải vấn đề có thể trong mẫu mình lấy từ khuẩn lạc vẫn chứa gene mà mình đem ligation phải không ạ? Như vậy rất có thể mình PCR cái gene đó chứ không phải PCR plasmid.

 

[Biologist]

Clony-PCR gặp phải vấn đề có thể trong mẫu mình lấy từ khuẩn lạc vẫn chứa gene mà mình đem ligation phải không ạ? Như vậy rất có thể mình PCR cái gene đó chứ không phải PCR plasmid.

Bạn Hồng Nhung:
Khi làm PCR, thông thường thì Bạn cần phải có hai primers. Sau đây là hai phương pháp làm colony-PCR thông dụng nhất hiện nay. Cả hai phương pháp sau đây đều dùng it nhất là 1 primer annealing với sequence của vector cho nên sẽ không amplify the endogenous copy của endogenous gene.

1) Dùng primer thứ nhất annealing với sequence của vector và primer thứ hai annealing với sequence của insert. Dùng phương pháp này sẽ Bạn biết được identity và orientation của insert.

2) Dùng cả hai primers annealing với sequence của vector (flanking the cloning sites). Dùng phương pháp này sẽ Bạn biết được số copy cua insert, nhưng lại không biết được identity và orientation của insert.

Bạn nên trao đổi với giáo sư hướng dẫn của Bạn về hai phương pháp nói trên để chọn phương pháp nào phù hợp với Bạn.

Chúc thành công,

 

[Trịnh Thị Hồng Nhung]

Cho em hỏi làm thế nào để biết được đoạn gen của mình (sản phẩm PCR) đã được cắt rồi. Liệu có trường hợp enzyme không thể cắt được không, ví dụ enzyme bị hỏng hoặc đoạn mồi thiết kế không phù hợp?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn nên clone vào một vector tạo dòng rồi mới cắt, như vậy sẽ biết chắc là đoạn gene của bạn đã được cắt. Còn bạn cắt từ PCR thì khó mà biết được đoạn gene của bạn đã bị cắt hay chưa.

 

[tran van giang]

Cho em hỏi làm thế nào để biết được đoạn gen của mình (sản phẩm PCR) đã được cắt rồi. Liệu có trường hợp enzyme không thể cắt được không, ví dụ enzyme bị hỏng hoặc đoạn mồi thiết kế không phù hợp?

Khi em PCR với clone như em nói, sẽ có trường hợp đó xảy ra, tốt nhất để loại trường hợp đó, em PCR với mồi bao ngoài của vector, đừng PCR với mồi đặc hiệu của gene chèn.

 

[tran van giang]

Clony-PCR gặp phải vấn đề có thể trong mẫu mình lấy từ khuẩn lạc vẫn chứa gene mà mình đem ligation phải không ạ? Như vậy rất có thể mình PCR cái gene đó chứ không phải PCR plasmid.

Khi em PCR với clone như em nói, sẽ có trường hợp đó xảy ra, tốt nhất để loại trường hợp đó, em PCR với mồi bao ngoài của vector, đừng PCR với mồi đặc hiệu của gene chèn.