Tủa enzyme bằng cồn hay muối

[Nguyễn Duy Hưng]

các bạn nào đã làm về tủa enzyme từ dịch nuôi cấy có thể giúp mình mấy câu hỏi sau:
- enzyme nên tủa bằng cồn hay muối NaCl ( ở đây enzyme amylase nuôi từ baccillus sp.)
- nếu tủa bằng muối thì cách nào là tốt nhất. mình có làm hai cách sau nhưng thấy không có hiệu quả
+ đổ muối ?khan vào dịch nuôi cấy cho đến khi bão hòa.
+ pha dung dịch muối bão hòa ở nhiệt độ cao sau đó làm nguội và tủa với dịch nuôi cấy.
bạn nào có góp ý gì về hai cách trên hay có cách nào khác thì cho mình biết nha.
- khi tủa bằng cồn (96 độ ) và đem ly tâm lạnh (6000 rpm, 10 ph) thì lượng tủa thu đc rất thấp, trong dung dịch vẫn còn lơ lửng huyền phù mịn của enzyme, vậy có cách nào tăng khả năng kết dính với nhau của hệ tủa này không ( không thể tăng số vòng quay nữa đâu, 6000 rpm là maximum rồi).
- tủa bằng cồn hay muối thì giữ được hoạt tính enzyme tốt hơn.
cám ơn trước nghen.

 

[Trương Quốc Phong]

Some hints:
Đọc bài viết của bạn tôi thấy cần lưu ý bạn 1 số vấn đề sau:
1. Bạn nên tìm hiểu kỹ hơn về đặc tính của proteins (đã được nói khá rõ trong giáo trình Hóa sinh đại cương), đây cũng là đặc điểm quan trọng của người làm nghiên cứu, vì càng hiểu rõ về đối tượng của mình ta càng dễ làm chủ được nó hơn và làm đúng. Khi đó, bạn sẽ hiểu được tại sao bạn lại dùng phương pháp như vậy (bạn sẽ là người chủ động chứ không phải là bị động).
2. Quay lại vấn đề bạn cần hỏi:
Đối tượng của bạn là enzyme, nên bạn cần rất cẩn thận khi làm việc với nó để đảm bảo cho nó còn hoạt tính trong suốt quá trình nghiên cứu. Ở đây đối tượng của bạn là enzyme amylase nên nó cũng không ''khó tính'' lắm. Hai phương pháp mà bạn dùng là 2 phuơng pháp thường được sử dụng nhất vì nó tương đối đơn giản và không đắt, mặt khác nó lại rất phụ hợp với qui mô lớn.
Tuy nhiên, trong 2 phương pháp đó có mấy điểm bạn cần lưu ý là:
- Người ta thường dùng muối (NH4)2SO4 để kết tủa proteins chứ rất hiếm khi dùng NaCl. Tùy từng loại proteins mà nó sẽ kết tủa ở nồng độ % bão hòa khác nhau, do vậy muốn biết bao nhiêu phần trăm bão hòa là tốt nhất thì bạn cần phải thử vài nồng độ khác nhau, và nên cho ''dần dần'' muối khan vào đến % bão hòa mong muốn (tính toán lượng muối trước). Tại sao lại như vậy? đó chính là nguyên tắc của phương pháp này, tôi không muốn nói ngay mà muốn bạn tìm hiểu (vì bạn đang là sinh viên mà), nếu cần tôi sẽ giải thích sau.
- Dùng cồn để kết tủa: bạn phải lưu ý đến nồng độ cồn trong dung dịch, thông thường người ta thường dùng ở nồng độ cuối cùng là > 75%, tương đương với 2 lần thể tích cồn 1 lần thể tích dịch chiết.
Cả 2 phương pháp này đều phải được thực hiện ở điều kiện lạnh (phương pháp 1, thực hiện trên đá, phương pháp 2 thực hiện ở -20oC)
Một điều khó khăn đối với bạn đó là bạn chỉ ly tâm được ở 6000 rpm, ở tốc độ này chắc chắn hiệu quả thu hồi không cao. Muốn được tốt hơn chỉ còn cách kéo dài thời gian ly tâm, 30-45 phút, nhưng cũng không cải thiện nhiều lắm. Nhìn chung, theo tôi thì tủa bằng muối sẽ tốt hơn (còn tùy thuộc vào từng loại proteins). ?Nhưng khi tủa bằng muối bạn sẽ phải tiến hành loại muối sau kết tủa theo 1 số phương pháp.
Chúc bạn thành công.

 

[Nguyễn Duy Hưng]

Cám ơn anh đã viết bài. em cũng có một số điều muốn hỏi
enzyme amylase thường có ion Ca để ỗn định hoạt tính, nếu ta dùng amoni sulfat để tủa thì có xuất hiện kết tủa calsium sulfat không.
Phương pháp cho muối khan vào dịch enzyme cho đến khi đạt bão hòa em đã từng làm rồi. Nhưng gặp vấn đề sau: nếu cho lượng muối tính toán dựa trên độ tan tương ứng thì không thể nào hòa tan hết muối được, muối vẫn còn không tan khá nhiều. Nếu cho từ từ cho đến khi muối không tan nữa (không cần tính) thì thực chất lượng muối cho vào vẫn chưa đạt đc bão hòa như trong bảng tra độ tan.
Ở phòng Tn của bộ môn em thì chỉ có máy ly tâm tối đa là 6000 rpm thui. Vì vậy khi tụi em tủa bằng muối thì huyền phù rất mịn, chỉ cần lắc nhẹ là lại phân tán vào dung dịch, rất khó tách tủa. Còn nếu tủa bằng cồn thì huyền phù lại kết dính với nhau thành một khối lớn nên dễ tách hơn.

 

[Trương Quốc Phong]

enzyme amylase thường có ion Ca để ỗn định hoạt tính, nếu ta dùng amoni sulfat để tủa thì có xuất hiện kết tủa calsium sulfat không.

Đúng như vậy, thông thường thì ion Ca có vai trò làm bền hoạt tính của enzyme, nhưng có một điều thế này khi dùng muối hoặc cũng như các chất khác để kết tủa enzyme thì đồng nghĩa là chúng ta đã làm biến tính enzyme rồi nhưng mà bạn biết đấy enzyme có thể có 2 dạng biến tính : có thể phục hồi và không thể phục hồi (sách hóa sinh cơ bản cũng nói rất rõ, hoặc bạn có thể tham khảo ở cuốn sách Principle of Biochemistry của ?Lehninger). Trong trường hợp của chúng ta là có thể phục hồi, tuy nhiên để giảm thiểu sự bất hoạt chúng ta nên thực hiện trong điều kiện lạnh. Hoạt tính của enzyme sẽ được phục hồi khi bạn hòa tan trong đệm thích hợp cho enzyme.
Đó là vấn đề lý thuyết, còn thực tiễn thì người ta đã dùng phương pháp này cho chính enzyme này từ cách đây khoảng 20 năm rồi, nên bạn cứ yên tâm.

Còn ở nồng độ nào sẽ cho kết quả cao nhất, thì như tôi đã nói bạn cẩn phải thử ở "1 số nồng đồ % bão hòa khác nhau".

 

[quocthang]

Chào anh và mọi người. Em cũng có vấn đề tương tự muốn nhờ mọi người giúp đỡ.

Em đang làm đề tài thiết kế thu nhận enzyme protease từ vk bacillus subtilis. Em đang làm đến phần tính toán lượng muối (NH4)2SO4 thêm vào để kết tủa: Nồng độ cuối của muối là 70% độ bão hòa.

Cho em hỏi nồng độ này có phải được hiểu là sau khi thêm hết muối vào dung dịch thì nồng độ muối trong dung dịch phải đạt 70% độ bão hòa của muối hay không.

Em tìm thấy công thức tính lượng muối thêm vào dạng khan như sau:

X(g) = 0.015xVx(S2-S1)/(1-0,272xS2)

trong đó
X là khối lượng muối cần thêm vào
V là thể tích dung dịch enzyme thô có nồng độ chất khô 8g/l
S1 là độ bão hòa cho trước
S2 là độ bão hòa cần thiết

Em đang phân vân là S1 = bao nhiêu?, và S2 = bao nhiêu?

Mong mọi người giúp đở. Em cảm ơn ạ.