Hỏi về thôi gel

[ngaytho]

Các bác vào đây giúp em một tay với. Em chạy PCR nhân lên đoạn dài 1kb mục đích để thôi gel lấy đoạn này rồi cắt bằng enzym giới hạn và sau đó ligate vào vector. Vấn đề là em PCR mãi mà sản phẩm vẫn smear và band không thật rõ. Vậy nếu em cố elute cái băng này thật chính xác thì liệu em có thể làm tiếp các bước tiếp theo thành công không?
(Line thứ nhất là mẫu, line 2 là marker 100 bp)

___________________________________

HÃY ĐAM MÊ VÀ BIẾN NIỀM ĐAM MÊ ẤY THÀNH SỰ THẬT !

Hãy lắng nghe tiếng nói của lòng đam mê,
hãy chắp đôi cánh cho tâm hồn bay bổng;
và hãy để bài hát nào cũng được hát lên....​

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Băng bạn mờ quá? Bạn load bao nhiêu ul từ tổng thể tích PCR?
Thường tôi load 5 ul từ tổng thể tích 50 ul thì băng đã đậm lắm rồi.
Nếu bạn load toàn bộ thể tích còn lại lên gel thì có thể bạn thấy băng rõ hơn. Bạn thôi băng đó rồi kiểm tra lại nồng độ dùng BamHI ladder. Nếu trên vài chục ng là bạn có thể tha hồ ligation.

 

[Nguyễn Xuân Hưng]

Tốt nhất là điều chỉnh PCR sao cho sản phẩm càng đặc hiệu càng tốt, nếu không sau này khâu chọn dòng rất mệt.

 

[ngaytho]

Cái băng đó em load 10ul từ tổng thể tích 50ul ạ. Có lẽ em thử phản ứng PCR nốt 1 lần nữa cho chót xem sao.
__________________________

HÃY ĐAM MÊ VÀ BIẾN NIỀM ĐAM MÊ ẤY THÀNH SỰ THẬT !

Hãy lắng nghe tiếng nói của lòng đam mê,
hãy chắp đôi cánh cho tâm hồn bay bổng;
và hãy để bài hát nào cũng được hát lên....​

 

[tuan_pham_6885]

Bạn có thể đặc hiệu bằng PCR hơn cách tăng nhiệt độ annealing lên và cho thêm dimethyl sulfoxide (DMSO) vào phản ứng PCR. Nếu band không rõ hơn thì theo tôi bạn cũng có thể cắt cái băng kia. Có lần tôi gặp band còn smear hơn thế. Nhưng ligate vào vector vẫn OK. Good luck!

 

[ngaytho]

Em chào các bác! Em đang thôi gel cho phân đoạn xấp xỉ 100bp. Sau khi PCR, em thôi gel lần 1, rồi digest bằng enzym giới hạn mục đích tạo ra 2 đầu dính để sau này cloning và thôi gel lần 2. Nhưng sau 2 lần thôi gel em check lại thì thấy không thu được DNA. Kit em dùng là QIAquick Gel Extraction Kit. Em nghĩ có lẽ là do phân đoạn của em hơi ngắn nên khó thu. Có ai từng làm với phân đoạn ngắn thì chỉ giúp em với.
__________________________

HÃY ĐAM MÊ VÀ BIẾN NIỀM ĐAM MÊ ẤY THÀNH SỰ THẬT !

Hãy lắng nghe tiếng nói của lòng đam mê,
hãy chắp đôi cánh cho tâm hồn bay bổng;
và hãy để bài hát nào cũng được hát lên....​

 

[Nguyễn Xuân Trường]

PCR xong thôi gel -> cắt. Như vậy bạn thiết kế vị trí cắt của enzyme trong primer và đoạn văng ra sau khi cắt kích thước nhỏ (khoảng 6-7 nucleotide). Mình nghĩ sau khi cắt bạn có thể tủa luôn để loại bỏ muối và dùng sản phẩm tủa để ligate, không nhất thiết phải tinh sạch lại bằng thôi gel. Còn việc không thấy sản phẩm thì bạn cần kiểm tra sau khi thôi gel lần 1 lượng ADN bạn thu được có đủ để cắt không -> cắt -> tủa -> điện di kiểm tra -> ligate.

 

[ngaytho]

Có người mách cho em một cách như sau: Tăng gấp đôi nồng độ muối trong washing solution để tăng điện tích dương cho cột silica, nên em elute thành công rồi.
___________________________________

HÃY ĐAM MÊ VÀ BIẾN NIỀM ĐAM MÊ ẤY THÀNH SỰ THẬT !

Hãy lắng nghe tiếng nói của lòng đam mê,
hãy chắp đôi cánh cho tâm hồn bay bổng;
và hãy để bài hát nào cũng được hát lên....​