Thiết kế Primer !

[Nguyễn Quang Hưng]

Sorry mọi người nhé vì E là người đặt ra toppic này mà không có ý kiến gì cả, cũng vì mới bắt đầu làm về các thí nghiệm shpt mà không được học lý thuyết cơ bản và cũng chưa có kinh nghiệm gì nên chằng biết phải bàn luận gì cả. E có vấn đề này mong mọi người có kinh nghiệm trong diễn đàn giải đáp giúp nhé: Trong phản ứng PCR Tm rất quan trọng, mồi xuôi và mồi ngược đều có Tm khác nhau, vậy khi tính Tm của phản ứng thì tính thế nào ?. Thanks !

 

[Ho Huu Tho]

Sorry mọi người nhé vì E là người đặt ra toppic này mà không có ý kiến gì cả, cũng vì mới bắt đầu làm về các thí nghiệm shpt mà không được học lý thuyết cơ bản và cũng chưa có kinh nghiệm gì nên chằng biết phải bàn luận gì cả. E có vấn đề này mong mọi người có kinh nghiệm trong diễn đàn giải đáp giúp nhé: Trong phản ứng PCR Tm rất quan trọng, mồi xuôi và mồi ngược đều có Tm khác nhau, vậy khi tính Tm của phản ứng thì tính thế nào ?. Thanks !

Bạn có thể cho biết cụ thể là quan trọng như thế nào được không, hay tại sao lại quan trọng?

 

[Nguyễn Quang Hưng]

hic, E không được học lý thuyết mà Bác Tho ơi, hình như Tm là nhiệt độ để mồi bắt cặp với mạch khuôn mà.
Cho E hỏi thêm vấn đề này nữa: Có thể điều chỉnh p/u PCR để tìm được đoạn gene có kích thước xác định không ? ví dụ như muốn tìm đoạn gene có kích thước 300-500bp. Thanks !

 

[Ho Huu Tho]

Trong phản ứng PCR Tm rất quan trọng, mồi xuôi và mồi ngược đều có Tm khác nhau, vậy khi tính Tm của phản ứng thì tính thế nào ?

Đọc comment của bạn thấy bạn lưu ý như thế thì muốn hỏi để biết rõ ý của bạn để học hỏi thêm thôi, chứ mình thì cũng có được học lý thuyết hay có kinh nghiệm gì đâu. Thực ra là mình không hiểu ý bạn hỏi có liên quan để vế đầu của câu hỏi hay không. Lúc thiết kế thường bạn đã phải lưu ý đến mồi xuôi và mồi ngược có Tm không quá khác nhau, mục đích của việc này là để dễ dàng chọn được nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng PCR. Nhiệt độ gắn mồi cao quá sẽ làm cho hiệu suất bắt cặp của mồi với khuôn giảm, kết quả là làm giảm hiệu suất PCR, do đó chọn nhiệt độ gắn mồi cần dựa vào mồi nào có Tm thấp. Mặt khác, nhiệt độ gắn mồi mà thấp quá thì sẽ làm tăng khả năng mồi bắt cặp không đặc hiệu, kết quả là nhân cả sản phẩm không mong muốn, do đó chọn nhiệt độ gắn mồi cần dựa vào mồi nào có Tm cao. Tóm lại, cần dựa vào Tm của cả hai mồi để tính và tốt nhất là thiết kết hai mồi có Tm không quá khác nhau.

Có thể điều chỉnh p/u PCR để tìm được đoạn gene có kích thước xác định không ? ví dụ như muốn tìm đoạn gene có kích thước 300-500bp

Mình không hiểu được chính xác ý bạn muốn hỏi, nếu bạn giải thích rõ hơn thì tốt.

 

[nvhung]

hic, E không được học lý thuyết mà Bác Tho ơi, hình như Tm là nhiệt độ để mồi bắt cặp với mạch khuôn mà.

Thực ra mình cần phân biệt hai khái niệm Tm và Ta.
Tm là nhiệt độ nóng chảy của primer về mặt lý thuyết. khi thiết kế primer thì nên cố gắng thiết kế để cho Tm của 2 primer gần như tương đương nhau hoặc không lệch nhau quá nhiều.
còn Ta là nhiệt độ lai khi thực hiện phản ứng PCR về mặt thực nghiệm.
thường người ta phải khảo sát với gradient nhiệt độ trong khoảng T+/- 5oc.

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn nvhung đã nói đúng rồi đấy. Tm cho ta một ước đoán gần đúng về T annealing thôi. Mặc dù về logics ta muốn Tm của mồi xuôi và mồi ngược khớp nhau. Nhưng thực nghiệm chứng minh không cần phải tuyệt đối như thế.
Về thực hành thường người ta set Ta thấp hơn Tm khoảng 10 độ đổ lại. Chưa thấy ai nói đặt Ta cao hơn Tm. Phổ biến nhất là từ 55 đến 65. Có lẽ vì độ dài mồi chuẩn thường là từ 18-25.
Mời các bạn đọc thêm về 7 myths in Primer design trong cuốn Primer design rồi thảo luận tiếp (Methods in molecular biology)

 

[Ho Huu Tho]

Cảm ơn bác Lương giới thiệu mấy trang tài liệu bổ ích, đọc thấy hay quá nhưng không hiểu được hết. Trong bài có nói đến nearest neighbor model là cơ sở để tính Tm, vậy bạn nào biết cho mình hỏi nearest neighbor model dùng để dự đoán Tm của ADN cụ thể gì, có nguồn gốc từ đâu và tại sao lại được dùng cho mục đích này?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Bạn Thọ lưu ý tác giả thảo luận về các cách tính Tm của các phần mềm khác nhau. Với tư cách end-user thì không nhiều người quan tâm đến chi tiết thuật toán tính toán Tm của phần mềm lắm. Trừ phi bạn muốn cải thiện phần mềm.

 

[Ho Huu Tho]

Trong mấy trang tài liệu của bác Lương cung cấp có đoạn viết như thế này:

...The appropriate method for predicting oligonucleotide thermodynamics is the NN model (2,7). The NN model is capable of accounting for sequencedependent stacking as well as bimolecular initiation. As of 1996, there were at least eight sets of NN parameters of DNA duplex formation in the literature, and it was not until 1998 that the different parameter sets were critically evaluated and a “unified NN set” was developed (7). Several groups (7,24) came to the same conclusion that the 1986 parameters (25) are unreliable. Unfortunately, the wrong 1986 parameters are still present in some of the most widely used packages for PCR design (namely, Primer3, OLIGO, and VectorNTI)...

Như vậy có nghĩa là theo tác giả thì những phần mềm dùng để thiết kế primer mà dân mình thường dùng như: Primer3, VectorNTI đều là những phần mềm dựa trên thuật toán sai eek. Vì điều này nên mình muốn hiểu rõ hơn về những điều tác giả phân tích, về nearest neighbor model là gì, bạn nào biết thì chia sẻ nhé.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Mình không hiểu được chính xác ý bạn muốn hỏi, nếu bạn giải thích rõ hơn thì tốt.[/quote]

Thanks Bác nhé. ý E muốn hỏi : có thể điều chỉnh các chất hay điều kiện p/u PCR như thế nào để tìm ra đoạn gene mong muốn, vì E đang muốn tìm đoạn gene có kích thước khoảng 300-500bp nhưng làm mãi chỉ ra đoạn gene có kích thước 100-200 bp thôi.

 

[Ho Huu Tho]

...ý E muốn hỏi : có thể điều chỉnh các chất hay điều kiện p/u PCR như thế nào để tìm ra đoạn gene mong muốn, vì E đang muốn tìm đoạn gene có kích thước khoảng 300-500bp nhưng làm mãi chỉ ra đoạn gene có kích thước 100-200 bp thôi.

Mình nghĩ bạn cần tập trung ngay vào khâu thiết kế mồi để giải thích tại sao lại nhân đoạn gen kích thước 100 - 200 bp, nó do đâu mà có (tất nhiên cần giải đáp những câu hỏi này trong hoàn cảnh cụ thể của bạn), trong khi đoạn mong muốn có kích thước khoảng 400. Giải thích được điều này chắc sẽ có định hướng cho bước tiếp theo để thực hiện thành công.

 

[Nguyễn Quang Hưng]

Thank Bac Tho nhé. Có lẽ E sai ngay tư bước đầu lên thí nghiệm không có kết quả, để E làm lại nhé !

 

[Nguyễn Xuân Trường]

Các anh chị giải thích hộ em tại sao khi tổng hợp mồi, đầu 5' gắn gốc OH mà không phải phosphat?

 

[nvhung]

các anh chị giải thích hộ em tại sao khi tổng hợp mồi, đầu 5' gắn gốc oh mà không phải phosphat?

ồ. Có lẽ là bạn nhầm thì phải. đầu 3' mới gắn oh chứ?

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Có thể là do cách tổng hợp mồi (oligonucleotide synthesis) bằng phương pháp hóa học. Bạn đọc thêm ở đây:
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Oligocycle1.png

 

[blackkeycr]

Chào các bạn mình bên công ty Khoa học hợp nhất chuyên bán hóa chất thiết bị sinh học phân tử cho hãng Biorad , thiết kế sản xuất primer probe . Bạn nào có nhu cầu hóa chất làm đề tài liên hệ với mình sẽ có giá ưu đãi nhé. Mong các bạn ủng hộ
Phạm Xuân Thọ
United Scientific Co.
83/10 Bach Dang, Ward 2,
District Tan Binh, Ho Chi Minh,
Vietnam,
Tel: +84 336657245