Hỏi kinh nghiệm về kit thực hiện in vitro transcription

[Ho Huu Tho]

Mình đang muốn thực hiện phản ứng in vitro transcription, search trên mạng cũng tìm được khá nhiều thông tin liên quan nhưng không biết chọn lọc thế nào. Nếu bạn nào từng có nhiều kinh nghiệm rất mong được chia sẻ, nhất là trong việc thiết kế thí nghiệm, chọn kit, và những thất bại từng gặp.

 

[nehigoha]

bạn muốn transcribe DNA với wild-type hay modified nucleotides? Hồi xưa tôi hay dùng Ambion kits. Thực ra thì mua Nucleotide của Epibio có lẽ rẻ hơn. Mình cũng có thể tự làm txn buffer và T7 RNAP

 

[Ho Huu Tho]

bạn muốn transcribe DNA với wild-type hay modified nucleotides? Hồi xưa tôi hay dùng Ambion kits. Thực ra thì mua Nucleotide của Epibio có lẽ rẻ hơn. Mình cũng có thể tự làm txn buffer và T7 RNAP

Minh muon thong qua PCR de tao dot bien, roi dung san pham PCR nay (khoang 300 bp gi do) de transcribe luon ma khong clone vao vector. Lam nhu vay co van de gi khong nhi?

 

[nehigoha]

in vitro txn sử dụng T7 RNAP. Như vậy có nghĩa là PCR của bạn cần có T7 promoter. Nếu bạn okie với vài extra nucleotides ở 5' end thì không có vấn đề gì.
Tôi mới txn PCR product khoảng 100bp thôi. 300bp hơi dài, nhưng T7 không stall như prokeryote và eukaryote RNAP nên có lẽ không sao. Tuy nhiên, bạn nên kiểm tra RNA quality cho chắc.
Một số người thêm 3' hammer head ribozyme vào cuối RNA để ribozyme này tự cleave off, khiến cho độ dài của RNA đồng đều hơn.
btw, nếu không in vitro txn RNA thì bạn tổng hợp và tinh chế RNA như thế nào?

 

[Ho Huu Tho]

in vitro txn sử dụng T7 RNAP. Như vậy có nghĩa là PCR của bạn cần có T7 promoter. Nếu bạn okie với vài extra nucleotides ở 5' end thì không có vấn đề gì.
Tôi mới txn PCR product khoảng 100bp thôi. 300bp hơi dài, nhưng T7 không stall như prokeryote và eukaryote RNAP nên có lẽ không sao. Tuy nhiên, bạn nên kiểm tra RNA quality cho chắc.

Minh cung du dinh se them T7 promoter seq vao dau 5´cua foward primer PCR va lay san pham PCR nay de tien hanh invitro transcription. Cai ban de cap ve chieu dai cua PCR product minh hoi lo, chac minh se phai tim hieu them tai lieu ve cho nay cho chac. Cam on Nê da canh bao.

Một số người thêm 3' hammer head ribozyme vào cuối RNA để ribozyme này tự cleave off, khiến cho độ dài của RNA đồng đều hơn.

Cai nay hay qua nhi, de minh doc them tai lieu, minh mu tit ve cai ribozyme nay qua.

btw, nếu không in vitro txn RNA thì bạn tổng hợp và tinh chế RNA như thế nào?

Sau khi invitro transcription, minh se xu ly bang DNAse I va tinh sach bang phenol:chloroform thoi, khong biet la co cach gi hay hon khong nhi. Ah, ma dinh luong cai RNA thu duoc bang do pho da la chinh xac nhat hien nay chua nhi?

 

[nehigoha]

Sau khi invitro transcription, minh se xu ly bang DNAse I va tinh sach bang phenol:chloroform thoi, khong biet la co cach gi hay hon khong nhi. Ah, ma dinh luong cai RNA thu duoc bang do pho da la chinh xac nhat hien nay chua nhi?

Để thu RNA tinh, các lab thường run acrylamide gel rồi sau đó cut gel bands và elute, ppt. Xác định nồng độ RNA bằng cách đo absorbance ở 260nm là chuẩn rồi.

Nhưng câu hỏi của Nê là:
Minh muon thong qua PCR de tao dot bien, roi dung san pham PCR nay (khoang 300 bp gi do) de transcribe luon ma khong clone vao vector. Lam nhu vay co van de gi khong nhi? nghĩa là sao?
Ban đầu Nê tưởng là bạn định làm in vivo txn. yuck!
Có lẽ ý bạn là in vitro txn với PCR product, thay vì linearized plasmid?

 

[Ho Huu Tho]

Nhưng câu hỏi của Nê là:
Minh muon thong qua PCR de tao dot bien, roi dung san pham PCR nay (khoang 300 bp gi do) de transcribe luon ma khong clone vao vector. Lam nhu vay co van de gi khong nhi? nghĩa là sao?
Ban đầu Nê tưởng là bạn định làm in vivo txn. yuck!
Có lẽ ý bạn là in vitro txn với PCR product, thay vì linearized plasmid?

Uh, y minh hoi dung la nhu vay, hy vong lan sau minh se co kinh nghiem trinh bay cau hoi ro rang hon. Xin chan thanh cam on.

 

[Ho Huu Tho]

Tôi mới txn PCR product khoảng 100bp thôi.

Trước đây bạn dùng phương pháp gì để tinh sạch RNA sau khi xử lý với DNAse I? Đoạn RNA của mình có chiều dài khoảng 100 bp giống với trường hợp của bạn đã làm trước đây thì mình có thể dùng phenol/chloroform rồi tủa bằng cồn và NaOAc được không nhỉ? Trả lời giúp mình nhé.

 

[nehigoha]

run 8-10% acrylamide gel.
cut out the bands containing RNA.
then elute it with buffer or water
last, ethanol precipitate it

 

[sinhvienhanoi]

Ban nen search Pubmed, Roeder (day la tac gia invent he thong nay) invitro transcỉption, Ad2 promoter:
day la mot vi du

Cell. 1979 Oct;18(2):469-84.

Selective and accurate initiation of transcription at the Ad2 major late promotor in a soluble system dependent on purified RNA polymerase II and DNA.
Weil PA, Luse DS, Segall J, Roeder RG.

Abstract
Transcription of Ad2 DNA templates in the presence of crude cellular extracts supplemented with exogenous (purified) RNA polymerase II is selectively and accurately initiated at the major late viral promoter at map position 16.45. Specific initiation has been demonstrated by a combination of hybridization, nuclease S1 mapping, size and partial sequence (fingerprint) analyses of the transcripts generated with various templates. With intact Ad2 DNA, transcription is terminated ell before the end of the 28 kb transcription unit is reached. With truncated templates (which contain intact promoter regions and several hundred base pair segments of the transcribed region) the expected run-off products are observed, along with a low level of prematurely terminated transcripts. The 560 nucleotide run-off product of the Sma l-f template (coordinates 11.6-18.2) was shown to contain all the large RNAase T1 oligonuc eotides that are characteristic of the corresponding in vivo transcript from this region; in addition, the 5 terminal undecanucleotide appears to be both capped and methylated. We have investigated various parameters (salt, metal ion and template concentrations) that affect the level of specific transcription in the crude system and have found that, under optimal conditions, specific transcription of Ad2 DNA continues for several hours. In addition, specific transcription initiation at the late promoter is observed with extracts derived from either virus-infected or uninfected KB cells and with class II RNA polymerases isolated from either human calf, murine or amphibian cells. RNA polymerase II from wheat germ does not function in this system.



Methods. 2009 Aug;48(4):353-60. Epub 2009 Mar 9.

Transcription of in vitro assembled chromatin templates in a highly purified RNA polymerase II system.
Guermah M, Kim J, Roeder RG.

Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology, The Rockefeller University, 1230 York Avenue, New York, NY 10021, USA. guermam@mail.rockefeller.edu

Abstract
In mammalian cells RNA polymerase II efficiently transcribes nucleosome-packaged DNA. In this regard, a fundamental question concerns the nature and mechanism of action of the accessory factors that are necessary and sufficient for, or enhance, transcription through nucleosomal arrays by RNA polymerase II. Here we describe a highly purified system that allows for efficient activator-dependent transcription by RNA polymerase II from the promoter through several contiguous nucleosomes on defined chromatin templates. The system contains natural or recombinant histones, chromatin assembly factors, the histone-acetyltransferase p300, all components of the general transcription machinery, general coactivators and the elongation factor SII (TFIIS). As examples of the applicability of this system for mechanistic analyses of these and other factors, representative experiments show (i) that activated transcription from chromatin templates is concomitantly dependent on the activator, p300-mediated histone acetylation and elongation factor SII/TFIIS. (ii) that SII/TFIIS acts in a highly synergistic manner with p300 (and histone acetylation) at a step subsequent to preinitiation complex (PIC) formation and (iii) that SII/TFIIS works directly at the elongation step of chromatin transcription. Here we describe purification methods for the different factors employed and the specific transcriptional assays that led to the above-mentioned conclusions. This purified system will be very useful as an assay system for the discovery of new factors or the mechanistic analysis of known or candidate factors involved in transcription initiation or elongation on chromatin templates, including factors that effect specific histone modifications or nucleosomal remodeling.

Noi chung day la mot assay rat de thuc hien, chuc ban thanh cong!

 

[nehigoha]

mammalian RNAP II có 12 subunits và thường fall off trong initiation
bacteriophage T7 RNAP là 1 enzyme, ko có subunit, và ko fall off trong transcription. vì vậy người ta dùng nó rất phổ biến trong in vitro txn

 

[Ho Huu Tho]

run 8-10% acrylamide gel.
cut out the bands containing RNA.
then elute it with buffer or water
last, ethanol precipitate it

Cái này nên chạy gel biến tính hay không nhỉ, mà dùng chất gì để hiển thị band RNA được? Dùng SYBR I có được không?