What's new

Hỏi về kinh nghiệm dùng Phusion polymerase cho PCR

VET

Member
Mình vẫn chạy PCR với Taq và pfu để nhân các đoạn gen của vi rút cúm và làm vi rút tái tổ hợp. Do vậy tỷ lệ đọc sai sẽ ảnh hưởng rất lớn đến sự thành công khi tái tổ hợp. Mình đọc mấy bài báo thấy họ khuyên dùng Phusion polymerase để có độ chính xác cao nhất. Do vậy mình đặt mua enzyme này về dùng nhưng đến nay vẫn chưa chạy PCR thành công (không lên band -mặc dù chạy với taq vẫn lên). Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của mọi người.
 
Toi da san xuat duoc pfu, co hoat luc cao rat nhieu co voi sap van tuong tu cua fermentas, Thermo ...., neu can co the duoc dung thu, nhung neu dung nhieu phai dan mua
 
anh chị bạn VET da xem ty le GC trong DNA muon sao chep chưa, nếu tỷ lệ GC cao thi đòi hỏi inital Denatur 95 đầu tiên là phải hơi dài đấy, và không biết độ dài Gen cua VET muốn làm là bao nhiêu , tôi làm với 1100bp thi initial denatur la tận 5 phút nhưng thực ra càng ngắn càng tốt. còn denatur tiếp là 60s, ah cái nữa la lượng template chỉ khoảng 0,2 µg là ok, lúc chiều tui vừa làm và rất ok. tui đã làm vói pfu mấy lần nhưng lúc mấy hôm cư không tập trung lúc thì dặt elongation ngắn , lúc thì này nọ nên không có product, tui được một đồng chí ở fermentas tư vấn và gửu cho high fidelity , lúc chiều thấy ổn rồi .
có gì mai lên lab tui đọc lái cái mail đồng chí kia xem sao , có gì lại trao đổi tiếp !
 

VET

Member
Các gen mình làm dài 2,2kb và 2,3kb, tỷ lệ GC khoảng 43-44% (đã có sẵn sequence: GenBank EU662956 và EU662960). Đây là gen của vi rút RNA(-) nên mình tạo template là cDNA từ một RT, và lượng template này dùng cho mỗi reaction 50ul trong pcr là 2-4ul. Mình làm với pfu và taq thì có band nhưng vẫn template và primers này mình dùng phusion polymerase thì không thấy band. Một lưu ý nữa là có 1 lần mình dùng 1 cặp primers để PCR(với phusion enzyme) đoạn giữa dài 1200bp của gen 2,2kb (chạy gradient với T annealing từ 61 đến 69 độ) thì đều có band. Do vậy theo mình hiểu thì có thể loại trừ trường hợp enzyme không hoạt động và template bị gãy.
Chương trình chạy cơ bản như sau:
Với Taq và pfu: 94 độ 2 phút sau đó 35 vòng tiếp theo 94/20s; 58-66/30s; 72/4min(taq) hoặc 10min(pfu). Sau cùng là 72/10min và giữ ở 4oc.
Với Phusion mình đã thử: 94 hoặc 98 độ 30s-2mins sau đó 35 vòng tiếp theo 98/10s; 61-69/30s; 72/1-6mins. Sau cùng là 72/10mins và giữ ở 4oc.
 
Chà, không cập nhật kiến thức dạo này nhiều enzyme tên lạ ghê :mrgreen:
Bạn VET có thử dùng Nested không? Thử chơi thêm 1 cặp Primer nằm flanking 2 cái gene này xem sao. Nhiều khi mồi mình thiết kế ở vùng trong gene không hiệu quả lắm.
 

Nguyễn Xuân Hưng

Administrator
Với PCR không lên thì không có cách nào khác là dùng thực nghiệm giải quyết.

- Thay đổi nồng độ template
- Thay đổi Ta (bạn dùng gradient trong trường hợp này là đúng rồi, nhưng vì sao chọn dải nhiệt độ 61-69 mà không phải từ 50-60).
- Thay đổi thời gian gắn mồi (nâng lên 45s thử xem)

Chú ý trong trường hợp template của bạn là cDNA thì nên tăng nồng độ template và thời gian gắn mồi lên so với bình thường.
 

VET

Member
- Mình cũng chỉ mới tập làm về cloning, chưa bao giờ chạy nested cả. Vì genome của vi rút này là 8 RNA riêng lẻ, mình nhân lên toàn bộ chiều dài của cac RNA từ nu đầu tiên đến nu cuối cùng luôn.
- Mình chạy Ta từ 61-69 do:
Thứ nhất, theo khuyến cáo:
General instructions
GUIDE
Use 98°C for denaturation.
Anneal at Tm +3°C (> 20 nt) or use 2-step protocol.
With Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase use
annealing temperature of 60°C or higher.
Use 15-30 s/kb for extension. Do not exceed 1 min/kb.
Use Phusion High-Fidelity DNA Polymerases at 0.5-1.0 U per 50 μl
reaction volume. Do not exceed 2 U/50 μl.
Use 200 μM of each dNTPs. Do not use dUTP.
Note: Phusion DNA Polymerases produce blunt end DNA products.
Thứ hai, lần trước chạy với pfu thì mình thấy band tốt nhất ở Ta khoảng 63,5 độ.
MÌnh cũng đã thử chạy Ta từ 55-61 rồi nhưng chưa thấy kết quả.
Nghe bạn Hưng nói ‘Với PCR không lên thì không có cách nào khác là dùng thực nghiệm giải quyết’ mình hơi bị choáng nhưng nghĩ lại thì cũng chẳng có cách nào khác. Đành phải hành động vậy.Tổng hợp các ý kiến của mọi người hôm nay mình thử tăng gấp đôi lượng template và chạy chương trình: 98 độ/2mins. Sau đó 35 vòng với 98độ/10s; 50-60độ/45s; 72 độ/6mins. Cuối cùng là 72 độ/10mins và giữ ở 4 độ. Thời gian chạy này hết hơn 5h nên phải đến sáng mai mới có thể biết kết quả.
Đang lo quá vì lần trước mình đề xuất thay Taq bằng pfu rồi bây giờ lại đòi mua cái phusion này. Enzyme dùng gần hết rồi mà chưa có kết quả gì. GS sẽ nổi giận mất.
Rất cảm ơn các góp ý của mọi người.
 

VET

Member
Vẫn chưa được bà con ạ. Ở các tube có Ta dưới 56 độ thì không thấy gì còn các tube Ta cao hơn thì có 1 band không đặc hiệu khoảng hơn 1kb nhưng cũng rất mờ.
Không biết phải làm gì bây giờ bà con?
 
Trường hợp Pfu mà vẫn chạy ra thì cứ clone và sequence đi chứ nhỉ. Dù sao nó vẫn tốt hơn Taq mà.
Còn enzyme mới mà không ra thì xem kit của nó có hóa chất test enzyme không, và tốt nhất là mail đến cty để hỏi cho ra nhẽ. Nếu test enzyme có vấn đề thì bắt cty nó đổi lot mới.
 

Ho Huu Tho

Member
- Mình cũng chỉ mới tập làm về cloning, chưa bao giờ chạy nested cả. Vì genome của vi rút này là 8 RNA riêng lẻ, mình nhân lên toàn bộ chiều dài của cac RNA từ nu đầu tiên đến nu cuối cùng luôn.
- Mình chạy Ta từ 61-69 do:
Thứ nhất, theo khuyến cáo:
General instructions
GUIDE
Use 98°C for denaturation.
Anneal at Tm +3°C (> 20 nt) or use 2-step protocol.
With Phusion Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase use
annealing temperature of 60°C or higher.
Use 15-30 s/kb for extension. Do not exceed 1 min/kb.
Use Phusion High-Fidelity DNA Polymerases at 0.5-1.0 U per 50 μl
reaction volume. Do not exceed 2 U/50 μl.
Use 200 μM of each dNTPs. Do not use dUTP.
Note: Phusion DNA Polymerases produce blunt end DNA products.
Thứ hai, lần trước chạy với pfu thì mình thấy band tốt nhất ở Ta khoảng 63,5 độ.
MÌnh cũng đã thử chạy Ta từ 55-61 rồi nhưng chưa thấy kết quả.
Nghe bạn Hưng nói ‘Với PCR không lên thì không có cách nào khác là dùng thực nghiệm giải quyết’ mình hơi bị choáng nhưng nghĩ lại thì cũng chẳng có cách nào khác. Đành phải hành động vậy.Tổng hợp các ý kiến của mọi người hôm nay mình thử tăng gấp đôi lượng template và chạy chương trình: 98 độ/2mins. Sau đó 35 vòng với 98độ/10s; 50-60độ/45s; 72 độ/6mins. Cuối cùng là 72 độ/10mins và giữ ở 4 độ. Thời gian chạy này hết hơn 5h nên phải đến sáng mai mới có thể biết kết quả.
Đang lo quá vì lần trước mình đề xuất thay Taq bằng pfu rồi bây giờ lại đòi mua cái phusion này. Enzyme dùng gần hết rồi mà chưa có kết quả gì. GS sẽ nổi giận mất.
Rất cảm ơn các góp ý của mọi người.

Những phần in đậm trong phần thực hiện của bạn là sai hoàn toàn so với hướng dẫn của bộ kít (phần in đậm). Như vậy nếu kết quả không tốt là do bạn chưa tuân thủ hướng dẫn của người ta. Không biết sau này bạn đã thành công với nó chưa?
 

Facebook

Top