Kinh nghiem voi Site directed mutagenesis..

[Lê Đức Dũng]

tuần rồi mình làm cái site directed mutagenesis (sdm)nhưng mà ...đang trục trặc nên viết lên đây mong nhận được chia sẻ những kinh nghiệm.
sdm của mình là replaces 1 base T thanh C (trong BamhI restriction site)
mình mua Kit của Agilent Technology (Quickchange II-E site dỉecctted Mutagenesis Kit)
Primer mình thiet ke tu PrimerX
minh đã làm ..nhu Kit va cloning nhung khong có khong co colony nao.
trong khi control thi ok ( control la Whitescrip plasmid và primer của Kit)

hom nay mình đã thủ làm vơi Taq bình thường, sau khi PCR minh cắt bằng BamHI xem PCR product có BamHI restriction site trong đó không nhưng cũng ..chả thấy gì.
mình nghĩ chắc có lẽ primer có vấn đề ...???!!!!

 

[Nguyễn Ngọc Lương]

Tức là có sp PCR nhưng không clone được vào plasmid bằng RE?
Nếu thế thì thử A-tail rồi clone bằng TA, rồi mới kiểm tra lại bằng RE thì chắc hơn.

 

[Cao Xuân Hiếu]

Khi tổng hợp primer có yêu cầu cty tinh sạch bằng FPLC hoặc PAGE k?

 

[Lê Đức Dũng]

Tức là có sp PCR nhưng không clone được vào plasmid bằng RE?
Nếu thế thì thử A-tail rồi clone bằng TA, rồi mới kiểm tra lại bằng RE thì chắc hơn.

không , cái này là làm PCR ma Plasmid và insert duoc copy luon, sau khi PCR xong template se duoc endonulease pha huy chi con lai PCR product, pCR product se duoc transformation truc tiep vao e coli XL1 Blue, e da thu control thi la ok roi , tuc la da co PCR product(cua control), XL1 blue cung ok
chi con lai simples la không hieu tai..răng, khong biet có PCR product cua simple không nứa hôm ay cũng lười cho len Gel để kiểm tra mà chơi luon transformation

Khi tổng hợp primer có yêu cầu cty tinh sạch bằng FPLC hoặc PAGE k?

cái này thì em không yêu cầu chỉ đặt qua mail sau nó gửi về, không biết nó có....tự làm cho mình không biết ....

 

[Vũ Hải Chi]

Mình có thử làm đột biến điểm dựa theo QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) và thấy một số chú ý bổ sung thêm:

- Sử dụng proofreading DNA polymerases (như Pfu...) để tránh tạo đầu thừa và hạn chế đột biến ngoài ý muốn
- Số chu kỳ PCR nên giảm thiểu
- Plasmid khuôn nên có kích thước dưới 10kb
- Tinh sạch hỗn hợp phản ứng sau khi xử lý endonuclease
- Check các dòng thu được cẩn thận, Pfu và Dpn I (endonuclease) có thể hoạt động không như lý thuyết

 

[Cao Xuân Hiếu]

1. Cty tổng hợp mồi nó ko tự làm đâu. Phải nói rõ vì sẽ tính thêm tiền

2. Elongation trong PCR phải đặt dài hơn so với tính toán trung bình (thường phải cần từ 8-10 min cho plasmid từ 4 -10kb)

3. Bắt buộc phải kiểm tra sản phẩm PCR trước khi ligation. Để còn biết mà phán.

4. Recommend: Phusion® High-Fidelity DNA Polymerase.

 

[Ho Huu Tho]

Nhân tiện xin ý kiến của các bạn có kinh nghiệm.

Mình muốn tạo một đột biến điểm trên sản phẩm PCR dài khoảng 100 bp, mình dự định sẽ thiết kế mồi chứa đột biến điểm đó rồi nhân PCR như bình thường mà không dùng kit nào cả. Không biết làm như vậy có ổn không, rất mong được tham khảo ý kiến của các bạn có kinh nghiệm.
Xin cảm ơn trước.

 

[Lê Đức Dũng]

Cảm ơn những lời góp ý.
Tình hình là sau lần dùng Kit không được thì em không dùng những thứ Kit cung cấp nữa mà sử dụng High-Fidelity DNA Polymerase ( hoặc Pfu cũng được), sau khi PCR thì dùng kit của GE tinh sạch sản phẩm rồi dùng DPnI để xủ lý Template, sau đó transformation, làm mini, nói chung analysis sơ bộ thì em đã có kết quả ok, lúc chiều gủi đi sequecing, chờ tuần sau là biết có bị mutant nào không.
Tóm lại là hơi bị phí tiền mua Kit ( 275 euro 10 reaction)) mua về giờ vất đấy, dùng những thứ mình có sẵn vần làm được, vì thực ra trong Kit cũng chỉ có mấy thứ như DNA Pol mix, compotente cell, DpnI...toàn những thứ mình đã có.
Nói chung những bước thực hiện thì làm theo Kit la ok, như PCR thì không cần bước Elongation cuối cùng, và khoảng 12-15 cycle là ok
to Huu Tho: Bác cứ thử đi, đăt Primer về thử xem thế nào, vì em làm của em thi lên đến gần 8Kb, còn sản phẩm ngắn thì không biết thế nào. Nếu bác làm xong để cloning thì thử làm như em xem thế nào, của em cũng tạo đột biết điểm đấy, chỉ thay C bằng T thôi.

 

[Ho Huu Tho]

Cam on da chia se kinh nghiem dang gia!

Cảm ơn những lời góp ý.
Tình hình là sau lần dùng Kit không được thì em không dùng những thứ Kit cung cấp nữa mà sử dụng High-Fidelity DNA Polymerase ( hoặc Pfu cũng được), sau khi PCR thì dùng kit của GE tinh sạch sản phẩm rồi dùng DPnI để xủ lý Template, sau đó transformation, làm mini, nói chung analysis sơ bộ thì em đã có kết quả ok, lúc chiều gủi đi sequecing, chờ tuần sau là biết có bị mutant nào không.
Tóm lại là hơi bị phí tiền mua Kit ( 275 euro 10 reaction)) mua về giờ vất đấy, dùng những thứ mình có sẵn vần làm được, vì thực ra trong Kit cũng chỉ có mấy thứ như DNA Pol mix, compotente cell, DpnI...toàn những thứ mình đã có.
Nói chung những bước thực hiện thì làm theo Kit la ok, như PCR thì không cần bước Elongation cuối cùng, và khoảng 12-15 cycle là ok
to Huu Tho: Bác cứ thử đi, đăt Primer về thử xem thế nào, vì em làm của em thi lên đến gần 8Kb, còn sản phẩm ngắn thì không biết thế nào. Nếu bác làm xong để cloning thì thử làm như em xem thế nào, của em cũng tạo đột biết điểm đấy, chỉ thay C bằng T thôi.

Cảm ơn bạn đã chia sẽ kinh nghiệm hay trong thực hành, và đưa ra những gợi ý thiết thực cho thí nghiệm của mình. Trong thí nghiệm của mình, mình muốn tạo cùng lúc mấy đột biến gần nhau, vì thế mình sợ primer có nhiều chỗ mismatch như vậy sẽ khiến PCR không nhân được sản phẩm. Bạn có thể chia sẻ một số kinh nghiệm trong việc thiết kế mồi cho PCR kiểu này không?

 

[Lê Đức Dũng]

Cảm ơn bạn đã chia sẽ kinh nghiệm hay trong thực hành, và đưa ra những gợi ý thiết thực cho thí nghiệm của mình. Trong thí nghiệm của mình, mình muốn tạo cùng lúc mấy đột biến gần nhau, vì thế mình sợ primer có nhiều chỗ mismatch như vậy sẽ khiến PCR không nhân được sản phẩm. Bạn có thể chia sẻ một số kinh nghiệm trong việc thiết kế mồi cho PCR kiểu này không?

Hôm nọ em dùng PrimerX để làm mồi chi phẩn ứng, thấy cũng ok , anh thử dùng xem thế nào. Cái này nó cho mình mấy cặp mồi và mình phải tự chọn thôi!

 

[nehigoha]

Trong thí nghiệm của mình, mình muốn tạo cùng lúc mấy đột biến gần nhau, vì thế mình sợ primer có nhiều chỗ mismatch như vậy sẽ khiến PCR không nhân được sản phẩm. Bạn có thể chia sẻ một số kinh nghiệm trong việc thiết kế mồi cho PCR kiểu này không?

PCR ko nhân được tại vì primer ko anneal với plsmd. Nếu như đoạn mismatch của bác flanked giữa 2 đoạn được anneal well với plsmd thì đâu có vấn đề gì đâu. Thậm chí có người còn design primer chỉ match 1 đầu với plsmd thôi. Khi làm như vậy họ có thể extend or shorten plsmd. pretty cool!